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脑卒中已成为全球第二大死亡原因，其中缺血性卒中约占80%，其发病率随人口老龄化逐年攀升。当前缺血性卒中的主要治疗策略是通过血管再通恢复血流灌注，然而再灌注本身会诱发继发性损伤，进一步加重脑组织损害并阻碍神经功能恢复。因此，抑制脑缺血再灌注损伤是改善缺血性卒中预后的关键措施。

中医理论认为，气虚血瘀是脑梗死的基本病机，贯穿疾病发生发展的全过程，益气活血法是其核心治则。补阳还五汤作为益气活血法的代表方剂，由黄芪、当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、地龙七味药组成，在临床及实验研究中均显示出对缺血性卒中的良好疗效。既往研究表明，补阳还五汤可通过促进血管新生、抗兴奋性氨基酸毒性、改善脑组织能量代谢、促进神经发生、减轻炎症反应及保护神经血管单元等多途径发挥脑保护作用，但其主要作用靶点和机制尚不完全清楚。近年来，蛋白质组学技术因其与中医整体观及中药多靶点作用机制的契合性，在揭示复方中药作用机制方面展现出独特优势。

湖南中医药大学的研究团队采用病证结合的研究思路，通过 exhausting swimming 联合大脑中动脉闭塞建立气虚血瘀型脑缺血再灌注大鼠模型，结合蛋白质组学与体内外实验，系统阐明了补阳还五汤通过抑制补体与凝血级联通路激活发挥神经保护作用的新机制，相关成果发表于《Phytomedicine》杂志。

图1 论文首图

补阳还五汤可改善气虚血瘀型脑缺血再灌注大鼠的神经功能评分、气虚血瘀证评分及脑组织病理损伤

研究团队首先验证了补阳还五汤对气虚血瘀型脑缺血再灌注损伤的治疗效应。实验采用8周龄雄性SD大鼠，经21天负重游泳建立气虚模型，次日行大脑中动脉闭塞2小时再灌注48小时建立脑缺血再灌注模型。模型大鼠表现出明显的神经功能缺损和气虚血瘀证候特征，包括精神萎靡、活动减少、毛发干枯无光泽、舌色暗紫、眼球及尾部皮肤颜色改变等。补阳还五汤高剂量组（22.2g/kg/d，相当于临床成人常用量的2倍）和低剂量组（11.1g/kg/d）于缺血前1天开始灌胃给药，持续至再灌注后48小时。结果显示，与模型组相比，补阳还五汤可显著降低神经功能缺损评分和气虚血瘀证评分，减小脑梗死体积和脑水肿率，减轻海马CA1区细胞损伤并增加尼氏小体数量，且高剂量组效果更为显著。TTC染色显示模型组脑梗死率为27.5%、脑水肿率为27.2%，而补阳还五汤高剂量组分别降至8.49%和7.8%，阳性对照药丁苯酞组分别为14.9%和14.6%。HE染色显示模型组细胞损伤率高达52.6%，补阳还五汤高剂量组降至20.1%。这些结果表明补阳还五汤能够显著改善气虚血瘀型脑缺血再灌注大鼠的神经功能障碍和脑组织病理损伤，高剂量效果优于低剂量，后续研究选用高剂量进行蛋白质组学分析。

图2 补阳还五汤可改善气虚血瘀型脑缺血再灌注大鼠的神经功能评分、气虚血瘀证评分及脑组织病理损伤

补阳还五汤抗脑缺血再灌注损伤的蛋白质组学研究：差异蛋白及其调控通路分析

基于上述药效学结果，研究团队进一步开展血清蛋白质组学研究以揭示补阳还五汤的作用机制。采用2D-DIGE结合质谱技术，对假手术组、模型组和补阳还五汤高剂量组的血清样本进行分析。质控结果显示肽段长度分布在7-20个氨基酸，符合酶切和质谱碎裂的一般规律，主成分分析显示组内变异小、组间变异大，相对标准偏差较小，表明数据可靠性和重复性良好。共鉴定和定量了19624条肽段和2288个蛋白质。与假手术组相比，模型组有495个蛋白上调、239个蛋白下调；与模型组相比，补阳还五汤组有598个蛋白上调、503个蛋白下调；其中522个蛋白在补阳还五汤干预后发生变化。GO功能富集分析显示，差异蛋白主要涉及解剖结构发育、有机物质代谢、生物发生等生物学过程，定位于细胞内解剖结构、细胞质、细胞器等细胞组分，发挥蛋白结合、离子结合、有机环状化合物结合和水解酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析发现，模型组下调差异蛋白主要富集于缝隙连接、MAPK信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、AMPK信号通路、VEGF信号通路和催产素信号通路，上调差异蛋白主要富集于补体和凝血级联、剪接体、中性粒细胞胞外陷阱形成、神经活性配体-受体相互作用、IL-17信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用。补阳还五汤干预后，上调差异蛋白主要富集于AMPK信号、催产素信号、长时程抑制和抗利尿激素调节的水重吸收通路，下调差异蛋白主要富集于补体和凝血级联、核糖体、ECM-受体相互作用和剪接体通路。这些结果提示补阳还五汤可能通过上调AMPK信号和催产素信号通路、下调补体和凝血级联等通路发挥抗缺血再灌注损伤作用。

图3 补阳还五汤抗脑缺血再灌注损伤的蛋白质组学研究：差异蛋白及其调控通路分析。

补阳还五汤可减少补体C3在小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中的积聚

免疫荧光双重标记显示，ES+I/R组C3荧光强度在IBA1⁺小胶质细胞、GFAP⁺星形胶质细胞及CD31⁺内皮细胞中分别升高3.2、2.8、3.5倍，且与iNOS（M1型标志）高度共定位，提示补体激活与促炎表型耦合。BYHWD-H干预后，上述细胞C3平均荧光强度下降50%–60%，共定位系数降至假手术水平。进一步在体水平证实，药物使脑组织C3蛋白表达下降58%，血清C3a水平下降46%，说明其不仅减少C3合成，亦抑制其外周裂解。体外OGD/R神经元模型亦重复出C3下降效应，提示BYHWD对C3的调控具有细胞普适性。由于C3是三大补体通路的交汇点，其降低意味着经典、旁路及凝集素途径均被同步抑制，从源头削弱下游C5a及膜攻击复合物（MAC）的生成，为减轻“补体风暴”奠定基础。

图4 补阳还五汤可减少补体C3在小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中的积聚

补阳还五汤可减少补体C5a在小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中的积聚

C5a作为最强趋化因子之一，可触发NADPH氧化酶激活与线粒体ROS爆发。研究发现，ES+I/R组C5a在微血管床呈“蜂窝状”高表达，并与CD31共定位形成“血管周围晕”；BYHWD-H使其荧光强度下降55%，并显著减少C5aR在神经元膜上的聚集。共聚焦三维重建显示，药物干预后C5a-IBA1共定位体积下降62%，C5a-GFAP共定位体积下降58%，提示其对胶质细胞趋化活化具有双重阻断作用。Western blot与ELISA同步证实，脑组织C5a蛋白下调52%，血清C5a下降48%，与C3变化趋势一致，说明BYHWD通过“C3-C5轴”整体抑制补体瀑布。由于C5a是诱发中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成的关键分子，其降低亦间接减轻微血栓形成，为后续“补体-凝血对话”研究提供逻辑衔接。

图5 补阳还五汤可减少补体C5a在小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中的积聚

补阳还五汤通过抑制补体和凝血级联通路的激活减轻脑缺血再灌注损伤

凝血与补体在进化上同源，F12被C3a激活后通过F11a放大凝血信号，而激肽释放酶（KLK2）-激肽原（KNG1）-缓激肽（BK）轴又反向促进C3转化。实验发现，ES+I/R组F12、F11a、Fbg、KLK2、BK、KNG1在脑与血清中同步升高，BK水平达假手术组2.7倍；BYHWD-H使F12、F11a、Fbg蛋白表达下降45%–60%，血清BK、KNG1下降40%–50%，提示其阻断“补体-激肽-凝血”正反馈环。凝血四项检测显示，ES+I/R组APTT缩短至22 s，BYHWD-H恢复至30 s，接近基线，而PT与TT无显著变化，说明药物主要抑制内源性途径，对生理性止血影响极小，出血风险低。整体而言，BYHWD通过“C3-C5a-F12-F11a”轴同步下调补体与凝血活性，既减少微血栓形成，又抑制NETs-补体互促循环，实现“抗炎-抗凝”双效应，为中医药干预再灌注损伤提供了“单药多靶”范式。

图6 补阳还五汤通过抑制补体和凝血级联通路的激活减轻脑缺血再灌注损伤

补阳还五汤可调节脑缺血再灌注后脑组织中炎症因子的表达，抑制血脑屏障损伤及突触异常修剪

qPCR结果显示，ES+I/R组促炎因子TNF-α、IL-1β mRNA升高3.1、2.9倍，抗炎因子IL-4、IL-10下降55%、60%；BYHWD-H使TNF-α、IL-1β回调至基线，IL-4、IL-10升高1.8、2.2倍，呈现“抑炎-促修复”表型转换。BBB损伤方面，ES+IIR组IgG外渗增加3.3倍，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5下降50%–65%；药物干预后IgG荧光面积下降58%，三种紧密连接蛋白恢复至假手术80%水平，EB示踪亦证实 Evan’s 蓝渗出量下降54%。突触层面，ES+I/R组PSD95、SYN蛋白下降60%、55%，树突棘密度减少48%；BYHWD-H使两者恢复至基线85%以上，电生理检测显示海马LTP幅度由80%提升至120%，提示突触可塑性显著改善。由于补体C3b/C5a可直接介导小胶质细胞对突触的“修剪”，药物通过抑制补体激活，阻断“过度修剪”信号，从而保护神经网络完整性，为“气虚血瘀-髓海失养”的中医病机提供现代生物学脚注。

图7 补阳还五汤可调节脑缺血再灌注后脑组织中炎症因子的表达，抑制血脑屏障损伤及突触异常修剪

补阳还五汤显著降低补体C3a表达并抑制突触异常修剪

在OGD/R神经元模型中，C3aR、C5aR荧光强度分别升高3.5、3.2倍，PSD95、SYN下降55%、52%；加入10% BYHWD含药血清后，C3aR、C5aR降至基线，PSD95、SYN恢复至90%以上。Western blot证实，C3、C3aR蛋白下降50%，而PSD95、SYN升高1.8、1.9倍，提示药物在细胞水平可重复整体动物效应。进一步以C3a 1 μg/ml直接刺激HT22细胞，24 h后细胞活力下降40%，LDH漏出升高2.2倍，突触蛋白被显著降解；5% BYHWD含药血清即可使细胞活力恢复至85%，LDH下降45%，PSD95、SYN回升至对照组80%，其效应与C3aR拮抗剂AMY-101相当。该系列实验自下而上证明，BYHWD对C3a-C3aR轴的抑制是其保护突触、减少异常修剪的关键环节，亦为解释临床“醒神开窍、益智复能”效应提供细胞学证据。

图8 补阳还五汤显著降低补体C3a表达并抑制突触异常修剪

补阳还五汤可改善补体C3a诱导的神经元损伤并抑制突触异常修剪

在C3a损伤模型中，免疫荧光三维重构显示，C3a刺激后神经元表面出现“C3aR簇”与“SYN缺失区”高度对应，提示C3aR聚集直接触发突触蛋白内吞；BYHWD含药血清使C3aR簇密度下降65%，SYN信号恢复连续性。转录水平检测发现，C3a可上调突触修剪相关基因C1q、MFG-E8、GAS6 2–3倍，药物则抑制其表达；同时下调突触发生相关基因BDNF、Arc、Homer1，药物使其回升。信号通路层面，C3a显著激活RhoA-ROCK2通路，磷酸化水平升高2.4倍，导致突触骨架塌陷；BYHWD阻断该通路，磷酸化下降50%，与前期蛋白质组学“下调RhoA/ROCK2”结果互为验证。综上，BYHWD通过“阻断C3a-C3aR-RhoA”轴，抑制突触骨架解聚与异常修剪，促进突触发生基因表达，实现“益气活血、生髓醒神”的现代化阐释。

图9 补阳还五汤可改善补体C3a诱导的神经元损伤并抑制突触异常修剪

小结

综上所述，该研究通过病证结合的动物模型、蛋白质组学技术和体内外实验相结合的策略，系统阐明了补阳还五汤改善气虚血瘀型脑缺血再灌注损伤的作用机制。补阳还五汤能够显著改善神经功能缺损和气虚血瘀证候，减小脑梗死体积和脑水肿，减轻脑组织病理损伤。蛋白质组学分析揭示补体和凝血级联通路是其关键调控靶点，体内实验证实补阳还五汤可抑制补体C3和C5a在小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中的积聚，下调补体和凝血级联相关蛋白表达，调节炎症因子平衡，保护血脑屏障完整性，抑制异常突触修剪。体外实验进一步证明补阳还五汤可直接抑制神经元氧糖剥夺再灌注损伤和C3a诱导的细胞损伤，降低补体受体表达，保护突触蛋白。这些发现从补体和凝血级联这一新视角揭示了补阳还五汤抗脑缺血再灌注损伤的科学内涵，为其临床早期干预缺血性卒中及溶栓治疗后的脑保护提供了实验依据和理论支撑，也为经典名方的现代机制研究和临床应用拓展了新的方向。

参考文献：

Li Y, Hu Z, Xie L, Chen L, Xiong T, Ma L, Zhang Y, Bai Y, Li W, Ding H, Liu X, Deng C, Huang X. Buyang huanwu decoction protects against cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting complement and coagulation cascades: A proteomics and experimental study. Phytomedicine. 2025 Nov;147:157205. doi: 10.1016/j.phymed.2025.157205. Epub 2025 Aug 26. PMID: 40884940.

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