液体活检是通过监测肿瘤或转移灶释放到血液、尿液或其他体液中的循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）及外泌体，提供肿瘤相关信息，进而帮助制定适当的治疗方法。相对其他标志物，ctDNA有着样本量足、时空稳定性好等独特优势，已在成人恶性肿瘤中得到了广泛的研究。与成年人相比，儿童癌症突变负荷通常较低，并且是由异质性突变驱动的。目前，ctDNA在儿童癌症，特别是白血病的疾病检测和监测中的实用性尚未得到证实。

美国圣裘德儿童医院研究团队在Leukemia发表了题为“Genomic profiling of circulating tumor DNA for childhood cancers”的文章。研究团队开发了一种针对儿童癌症细胞游离DNA样本中不同体细胞基因组变异的深度测序方法PeCan-Seq，该方法可通过DNA捕获Panel对儿童癌症相关的357个基因进行深度测序，以从头检测染色体拷贝数变异（CNA）和单基因变异。特别地，PeCan-seq能够从1mL血浆样本中灵敏地鉴定儿童血液系统恶性肿瘤和实体瘤亚型的异质性ctDNA改变。综上，PeCan-seq是一种稳健、非侵入的方法，可在诊断和疾病监测期间大大改善全面基因组分析和突变特异性检测。

文章发表在Leukemia

具体而言，研究团队在血液学癌症、实体肿瘤和脑癌中测试了PeCan-Seq，旨在评估PeCan-seq以与组织测序相似的速度检测cfDNA相关突变的能力，以及能否作为监测儿童血液学癌症的一种方法。结果表明，PeCan-Seq有望成为肿瘤组织诊断的无创辅助手段以及疾病监测平台。

图1. 总研究概述

01 PeCan-Seq检测cfDNA样本

cfDNA PeCan-Seq和分析工作流程旨在捕获不同类型的体细胞变异。除序列突变外，PeCan-Seq还能检测儿童癌症中的复发性结构变异（SV），不过Panel内的诱饵（bait）必须覆盖两个基因组断点之一（图2）。

图2. PeCan-Seq检测cfDNA的SV

为检测cfDNA样本中的亚克隆染色体畸变，如拷贝数变异（CNV）和拷贝中性的杂合性丢失（cnLOH）事件，研究团队开发了分析工具SubChrom，用于识别体细胞事件并量化PeCan-Seq数据中的ctDNA占比。经验证，SubChrom成功检测到超二倍体（图3A）、亚二倍体（图3B）、cnLOH和局灶性拷贝数增益/缺失（gain/loss）（图3C、D）。

图3. PeCan-Seq检测cfDNA中的CNV和cnLOH

02 体细胞变异检测和肿瘤负荷定量

接下来，研究团队收集了233名血液肿瘤、实体瘤和脑肿瘤儿童的诊断时血浆样本对PeCan-seq进行评估；这三种肿瘤类型取样时较为困难、所得到的组织标本也较少，且通常涉及到麻醉下的侵入性手术和相关并发症，对于儿童而言最好能避免这些并发症。

所有血液系统恶性肿瘤儿童（n=177）在诊断时均有可检测到的ctDNA；cfDNA中ctDNA占比的中位数为0.77，与诊断测序的原发性肿瘤纯度相当，原发性肿瘤纯度与ctDNA占比之间存在相关性。对于急性淋巴细胞白血病（ALL），最常见的突变基因是ETV6、PAX5和RUNX1。对于急性髓系白血病（AML），最常见的突变基因是RUNX1、NRAS和FLT3。

结果显示，该捕获Panel覆盖了肿瘤样本中81%的临床重要变异。PeCan-seq可在血液系统恶性肿瘤中最敏感地检测ctDNA，并在144名患者中发现了改变，由此产生的基因组图谱显示与患者匹配的肿瘤样本高度一致。789个预期的肿瘤变异中共有97%被鉴定出来，包括98%的单核苷酸变异（SNV）和插入或缺失（indel）、100%的内部串联重复（ITD）、95%的局灶性拷贝数增益/缺失、99%的嵌合基因融合、99%的染色体拷贝数畸变。

相比之下，该方法在实体瘤、脑脑肿瘤患儿中的检测效果较差，38名实体瘤患者中有19名中被检测到体细胞突变，18例脑肿瘤患者中有1例检测到DNA突变。

图4. 血液系统恶性肿瘤患儿肿瘤和cfDNA的体细胞改变

03 ctDNA监测白血病微小残留病灶

除识别相关突变外，研究团队还评估了PeCan-seq作为监测工具能否匹配或超过现有方法的性能，包括流式细胞术和骨髓活检。

研究团队对14名B-ALL儿童进行了PeCan-Seq，并在第0、15、22天和诱导化疗结束时收集了一系列样本；使用流式细胞术测定了上述连续血浆样本中的微小残留病灶（MRD）水平，并将其与PeCan-Seq数据进行比较。结果显示，PeCan-Seq成功检测到14名MRD水平不同B-ALL患者的癌症突变；ctDNA的体细胞变异与MRD水平相关。这些结果表明，PeCan-Seq可以补充现有方法，但还需要进一步研究。

图5. 通过ctDNA检测对B-ALL患儿进行MRD监测

04 单个样本中的多肿瘤检测

一名患儿被诊断出同时患有超二倍体B-ALL和神经母细胞瘤，诊断四个月后神经母细胞瘤复发，并具有明显的基因组特征；研究团队对其初诊前三天收集的血浆样本进行cfDNA PeCan-Seq和WGS分析。在cfDNA中检测到了与B-ALL、神经母细胞瘤原发诊断和/或神经母细胞瘤复发相一致的多种CNA，这表明在原发诊断时血浆样本中存在来自三种不同肿瘤实体的ctDNA。

在原发性B-ALL肿瘤样本中仅观察到了cnLOH事件和1q、10、21号染色体增益，诊断和复发的神经母细胞瘤样本都存在染色体增益和缺失。根据这些事件，研究团队估算了cfDNA占比，发现血浆cfDNA总量的54%来自B-ALL，8%来自诊断时的神经母细胞瘤，23%来自诊断时的神经母细胞瘤复发亚克隆，其余来自非肿瘤细胞。

图6. 在一个cfDNA样本中检测来自多个肿瘤的ctDNA

文章作者、圣裘德医院综合癌症中心副主任Charles Mullighan表示：“PeCan-seq具有几个独特而有价值的特征：检测样本仅需1mL血浆，便能够检测多种不同类型基因组改变（包括结构变异）；与全基因组或外显子组测序相比具有相对较好的成本效益”。

目前，研究团队正在尝试调整PeCan-seq，使其更好地用于实体瘤和脑癌患者，并优化监测血癌疾病的能力。"对于脑肿瘤，还有其他方法能更好地进行cfDNA分析，如对脑脊液进行采样，因此我们可能会将其细分并结合其他技术，以提高效率、成本和潜在的灵敏度。”Mullighan补充道。

此外，研究团队也在探索的其他领域包括RNA和细胞游离甲基化分析。Mullighan表示：“基于组织的甲基化测序已被临床应用于一些脑肿瘤中，在儿童实体瘤中显示出巨大潜力，因此我们希望拓展这个工具并评估这类方法”。

综上所述，该研究提出了一种专为儿童癌症设计的无创全基因组分析方法PeCan-seq，并发表了初步验证结果，证明了在诊断时使用血浆来源cfDNA对多种儿童癌症进行基因组表征具有较大的前景。PeCan-Seq方法能够补充现有检测方法；特别地，对于癌症易感性综合征患者，PeCan-Seq在侵入性最小的疾病诊断和治疗反应监测方面潜力巨大。

参考资料：

1.https://www.nature.com/articles/s41375-024-02461-x

2.https://www.genomeweb.com/cancer/st-jude-researchers-pioneer-new-liquid-biopsy-panel-targeting-pediatric-cancers