导读

DNA甲基化是生物体内最重要的表观遗传修饰。在哺乳动物中，DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶，5mC）、羟甲基化（5-羟甲基胞嘧啶，5hmC）与组蛋白修饰等方式一起，在调控基因表达和染色质构象等方面发挥了重要作用。目前，衡量DNA表观遗传学变化的分析一直依赖于对被修饰的核苷酸进行特定的“标记”，对这些不同表观遗传标记进行详细研究，可了解其联合效应和动态相互转换。但现有方法（基于亚硫酸氢盐或化学）无法同时检测5mC、5hmC这两种DNA修饰，特别是在数量有限的样本中。

近日，新加坡国立大学Lih Feng Cheow领导的研究团队在Science Advances上发表了题为“DARESOME enables concurrent profiling of multiple DNA modifications with restriction enzymes in single cells and cell-free DNA”的文章。研究团队提出了一种基于限制性内切酶、可同时检测多种表观基因组状态的DNA分析方法“DARESOME”。该方法通过测序可唯一识别全基因组中CCGG位点的DNA修饰状态，包括未修饰的胞嘧啶、5mC和5hmC，并同时进行定量分析。

利用DARESOME，该研究揭示了基因体中5hmC/5mC比值与基因表达的相关性，以及小鼠脑中与年龄相关的5mC/5hmC相互转换；在单细胞中，通过DARESOME可检测细胞之间的差异DNA甲基化。此外，该研究还证明DARESOME能够对cfDNA进行整合基因组、5mC和5hmC分析，有望在液体活检中发现多组学癌症特征。

文章发表在Science Advances

主要研究内容

DARESOME独特的工作流程

DARESOME方法并非直接转换核苷酸，而是根据CCGG上下序列中特定CpG位点的甲基化状态，将不同的DNA条形码（DNA barcode）附着到DNA片段上（图1），以同时进行表观遗传状态分析。该方法利用多种修饰敏感限制性内切酶反应；并具备U-tag、M-tag和H-tag等三个适配器序列，用于对未修饰的胞嘧啶-、5mC-和5hmc - CCGG位点进行差异标记。

DARESOME的主要优势是能够同时分析多个DNA修饰状态，有望在整合多层表观基因组信息时提高准确性、减少偏差并简化注释。此外，DARESOME另一个优点是单管工作流程，最大限度地减少了DNA损失，与亚硫酸氢盐转换方法相比，大大提高了可映射性。

图1. DARESOME的工作流程。

为评估DARESOME区分三种胞嘧啶修饰状态的能力，研究团队对三组分别含有未修饰胞嘧啶、5mC和5hmC的对照合成双链DNA进行了检测。结果显示，DARESOME具有高度的特异性和准确性，并可同时对基因组中CCGG位点未修饰胞嘧啶、5mC和5hmC进行准确量化。

DARESOME可实现对小鼠脑内5mC和5hmC分布的全基因组分析

为证明DARESOME在综合表观基因组分析中的效用，研究团队对从成年小鼠小脑中提取的基因组DNA进行DARESOME分析，并纳入了对照实验（图2）。结果显示，DARESOME方法准确性、重现性较高。此外，研究发现CpG中未修饰胞嘧啶在CpG岛和启动子中富集；5mC在内含子和重复区域中富集；5hmC在基因体和增强子中含量较高，但在CpG岛和启动子中几乎不存在。

为探究上述表观遗传标记之间的关系，研究团队按平均5mC水平对基因进行了排序，并绘制出相应的5hmC水平。结果显示，基因体中5hmC和5mC水平之间存在明显负相关；脑细胞中高表达的基因与基因体中高5hmC/5mC比值相关。5hmC与基因表达增加高度相关；5mC则与基因表达呈负相关。上述结果表明，利用DARESOME可揭示5mC和5hmC在小鼠脑内独特的基因组分布。

随着年龄的增长，脑中的神经元细胞会发生动态的表观遗传变化。为更好地了解不同DNA修饰随衰老的变化，研究团队通过DARESOME比较了幼年和成年小鼠小脑中DNA的表观遗传图谱。结果显示，衰老过程中大脑的主要表观遗传变化是5mC向5hmC的转化，未修饰胞嘧啶的分布相对不受干扰。在衰老过程中，5hmC与5mC的变化呈负相关。综上，该结果突出了DARESOME在研究基因组功能元件表观遗传调控方面的效用。

图2. 小鼠脑DNA的DARESOME分析。

DARESOME可实现单细胞表观遗传异质性的多模态分析

单细胞的表观遗传异质性可能会产生重要的生物学后果，但现有单细胞表观遗传检测方法仅针对单个DNA修饰。为评估DARESOME能否适用于检测单细胞的表观遗传差异，研究团队将DARESOME应用于单细胞分析（scDARESOME），并对5个H1胚胎干细胞（H1 ES）和5个HepG2癌细胞进行检测。

结果显示，在单细胞水平上，不同基因组区域的单个H1 ES细胞和HepG2细胞的胞嘧啶修饰分布明显不同：与单个H1 ES细胞相比，单个HepG2细胞显示出整体低甲基化和低羟甲基化。此外，研究团队在单个细胞中发现5hmC丰度存在染色体链不对称性，但这一现象在批量细胞的5hmC分析中不存在。这表明scDARESOME可同时分析单细胞中的5mC和5hmC，检测细胞之间的差异DNA甲基化，并揭示在批量细胞分析中被掩盖的重要差异和异质性。

图3. DARESOME用于单细胞分析。

DARESOME可实现cfDNA的多组学分析

cfDNA的各种遗传和表观遗传特征对于癌症等疾病的检测和表征非常有用。为探究DARESOME在非侵入性液体活检中对cfDNA进行多组学分析（cfDARESOME）的效用，研究团队使用cfDARESOME对4例健康血浆、13例结直肠癌（CRC）血浆和3例CRC原发肿瘤进行拷贝数变异（CNV）检测。cfDARESOME具有独特的文库制备方式，每个测序片段都锚定在CCGG位点上。

结果显示，健康受试者的cfDNA表现出一致的拷贝数特征；13例患者cfDNA的cfDARESOME分析揭示了患者之间的大规模基因组畸变差异。该研究还揭示了癌症患者cfDNA中整体5hmC水平下降的显著现象。综上，cfDARESOME可在单次检测中对拷贝数、5mC和5hmC进行综合分析，有望成为实现全面癌症监测的强大工具。

图4. DARESOME用于cfDNA分析。

结 语

综上所述，该研究报道了一种能够同时分析多种表观基因组状态的方法——DARESOME，特别是当无法分割有限数量的样本进行并行分析时。在CCGG环境中，DARESOME能够在一次反应中同时检测未修饰胞嘧啶、5mC和5hmC。利用DARESOME，该研究揭示了5mC和5hmC在基因表达调控中的相反作用以及其在小鼠大脑衰老过程中的相互转化，并发现了单细胞中明显的5hmC链偏差，为深入了解细胞分裂过程中产生的表观遗传异质性提供了见解。未来，DARESOME有望成为表观基因组综合分析的重要工具。

参考文献：

Viswanathan Ramya, et al."DNA Analysis by Restriction Enzyme (DARE) enables concurrent genomic and epigenomic characterization of single cells." Nucleic acids research 47.19(2019). doi:10.1093/nar/gkz717.