编译丨newborn

药物发现既昂贵又耗时。尽管在研发方面投入了大量资金，但自20世纪90年代以来，美国食品和药物管理局（FDA）批准的平均药物数量一直在下降。目前，每个被批准的新分子实体的研发成本约为18亿美元，再加上专利到期，使制药公司面临着艰巨的任务——开发更多的产品以维持其创新。此外，药物发现失败率的升高会降低对衍生化合物、微小配方变化或药物组合的原创研究热情。

决定药物发现成功的重要因素之一是体内药物动力学。这是指药物与其靶点的结合动力学，包括结合和解离时间，这会影响药物在体内的停留时间。随着制药公司更多地关注于优化靶点结合亲和力和选择性，药物动力学往往不被重视，尽管越来越多的证据表明动力学参数与药物疗效的相关性可能比亲和力参数更强。在此，本文将讨论用于研究药物动力学的实验和建模方法，以及如何利用它们来提高药物发现的成功率。

01 动力学的重要性

药物发现通常是通过在恒定药物浓度下通过一系列体外实验来识别和优化先导化合物。这些实验产生均衡量化指标，包括半数抑制浓度（IC₅₀）和平衡解离常数（K_D），用于预测药物活性。

然而，当药物进入人体时，由于胃肠道吸收、肾脏排泄和代谢等生理过程，它们的浓度会不断变化。因此，越来越多的人认识到，基于均衡（equilibrium）的模型来评估药物-靶点相互作用，对体内药理学的预测性较差，而能够捕捉药物动力学的模型更适用于描述体内非均衡情况下的动态药物-靶点相互作用。

02 结合及解离速率

表征动态药物相互作用的2个最基本的单位是结合速率常数（association rate constant/on-rate，k_on）和解离速率常数（dissociation rate constant/off-rate，k_off）。当一起使用时，这些参数可以洞察药物-靶点复合物的分子识别和稳定性。研究表明，药物停留时间（RT=1/k_off是药物疗效和选择性的关键预测因子，因为停留时间较长的药物能够通过减少靶点占有率的下降而产生更持久的作用，靶点占有率用于描述配体分子对靶点占据的程度。

虽然关于k_off和如何减少k_off的研究已经很多，但关于k_off及其对体内靶点占有率的影响的数据相对较少。有趣的是，Zhou与其同事们（doi:10.1002/psp4.12035）发现，与流行的观念相反，增加k_on可以延长靶点占有时间。这一发现表明了优化k_on和k_off的重要性。

IJzerman和Guo认为，对k_on的研究不那么重视的一个原因是对度量的普遍假设存在疑问。20世纪90年代初，Smoluchowski开发了一种数学方法来建模生物分子反应，例如受体和配体之间的分子反应。该模型适用于各向同性、非相互作用的球体，其中kon仅取决于分子的大小及其溶剂的粘度，即扩散受限。然而，当涉及到具有立体特异性的药物-靶点相互作用的建模时，假设k_on不变且扩散受限就不再有用了。例如，如果一个配体只能在特定的位置和方向上与其受体结合，k_on就会显著下降。另一方面，有利的静电吸引可以显著增加k_on。

03 实验工具

据了解，有多种技术可以测量k_on和k_off，最古老的方法之一是放射配体结合分析法，但它存在一些局限性，例如难以将放射性标记配体与游离配体分离。这种分析法也忽略了由于配体结合而在受体中可能发生的构象变化，G蛋白偶联受体就是这样一个例子。

一种流行的、无标记的方法是表面等离子体共振（SPR），其中药物-靶点复合物的形成会导致偏振光的折射率变化。它的优点是试剂和样品消耗量低，不需要标记，可以实时提供数据。SPR可用于测量各种分子之间的生物分子相互作用，包括蛋白质、离子和片段。然而，由于配体是分批测量的，通量仍然很低。此外，研究膜结合蛋白可能是一个挑战，因为偏离天然构象的蛋白质可能与其靶点具有不同的相互作用。此外，蛋白质需要稳定地结合到等离子体芯片上，这可能会限制这种方法的适用性。

可以说，目前使用最广泛的技术是荧光共振能量转移（FRET）和生物发光共振能量转移（BRET），因为它们具有高灵敏度、与活细胞状态的相容性，并且能够通过商业设计荧光探针用于多种蛋白质。

这2种方法的机理相似，依赖于能量从供体分子到受体分子的距离依赖性转移。为了使FRET和BRET能够很好地工作，供体和受体分子必须非常接近（分别为10–100Å和10nm）。在FRET中，分子之间也必须有光谱重叠。与FRET不同，BRET不需要外部光源来激发供体分子。因此，它具有非常低的干扰背景信号，例如与FRET相关的自发荧光、光散射和光漂白。

其他新兴的方法包括石英晶体微天平，它可以检测由于配体与细胞结合而引起的质量变化，以及荧光相关光谱术，它可以测量粒子荧光强度的波动，其中自由配体可以与缓慢扩散的受体结合配体区分开来，而无需物理分离。等温滴定量热法（ICT）可实时测量生化反应引起的热变化，并可直接读出酶活性对抑制剂结合的响应。例如，热信号的变化速率与抑制剂与酶的结合速率相关，这使我们能够计算结合速率常数。虽然ICT在药物动力学方面的应用受到限制（大部分应用是在热力学方面），但该技术已被用于确定共价和非共价抑制剂与脯氨酰寡肽酶（POP）的结合动力学参数，后者是治疗癌症和神经退行性疾病的一个有希望的靶点。

对药物动力学的日益重视导致了由欧洲创新药物计划（Innovative Medicines Initiative，IMI）与大型制药公司共同资助的K4DD（Kinetics for Drug Discovery，药物发现动力学）项目的诞生。该项目的一个主要发现是结合和解离速率常数受配体结构的强烈影响。读者可以参考ChEMBl数据库（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）了解生物活性化合物的结构=动力学关系。

04 计算建模工具

随着X射线晶体学和电子显微镜的进步，对药物-靶点相互作用动力学的分子理解有所提高。利用所得数据，研究人员开发了计算模型，以了解定量结构动力学关系（QSKR）。这些模型通常使用统计机器学习来获得药物-靶点复合物的结构信息或者使用增强采样的分子动力学模拟来建立。研究人员还将人工智能与分子模拟相结合，例如，Ribeiro等人利用神经网络从无偏分子动力学中学习，然后创建了一个新框架来研究苯与溶菌酶的解离，这是一种十分受欢迎的常被研究的配体-蛋白质复合物。

例如，苯的离解会在溶菌酶中形成一个空腔，从而影响蛋白质的性质，如变性温度和与特定配体的结合。这为优化蛋白质工程创造了机会。Decherchi和Cavalli写了一篇综述，总结了分子模拟和取样方法的进展。在他们的工作中，他们解释称，由于配体-蛋白质结合和解除结合的时间尺度范围很广，因此分子模拟捕捉大分子的实时动力学仍然具有挑战性。考虑到分子模拟中的时间步长为1飞秒，为了验证毫秒或秒级的采样事件，需要10¹²或10¹⁵个整合步骤，这超出了当前可用的计算技术。然后，作者总结了分子模拟对药物动力学的贡献，例如根据配体的药物停留时间对其进行排序。

05 展望未来

人体是不断变化的，因此捕捉动态药物动力学是一项挑战。这是复杂的，因为还有其他因素影响药物动力学。例如，动力学选择性，它指的是药物结合选定靶点（chosen target）而非结合脱靶（off-target）的相对能力。该参数提供了对不想要的不利影响的洞察。动力学选择性反过来又受到热力学性质的影响，例如吉布斯能（Gibbs energy）和结合焓（enthalpy of binding），它们提供了驱动药物-靶点相互作用的分子间作用力的根本信息。

进一步证实其重要性的是，动力学选择性反过来会影响靶点易受攻击性（target vulnerability），其定义为必须参与结合以引发所需响应的靶点比例。与高易受攻击性靶点相比，低易受攻击性靶点需要相对较高的药物暴露水平，才能达到药理学相关的靶点参与水平。这意味着，高易受攻击性靶点受到动力学选择性的强烈影响，因为产生一小部分活性靶点（例如靶点参与结合后通过药物离解）需要更多时间。

虽然预测药物动力学是复杂的，但随着实验和建模方法的不断改进，有望做出更好的预测来提高药物的疗效和安全性。

参考资料：Andy Tay, PhD：Assessing Kinetics in Drug Discovery