环状RNA（circRNA）是一种单链非编码RNA，普遍存在于从病毒到哺乳动物等多种物种中。circRNA具有高稳定性和保守的自然表达特异性，这使其不仅在生命过程中作为关键和独特的调控因子出现，而且在临床诊断标记物的开发和应用中也具有明显优势。目前，科学家已将发现了数以千计的环状RNA，它们的表达与发育阶段、生理状况和癌症等疾病有关。

但传统circRNA检测（RT-qPCR和FISH等）需要熟练的操作人员、专门的实验室和设备，并且处理时间超过24小时，并且许多疾病相关的circRNA丰度极低，因此快速、灵敏地检测circRNA仍然具有挑战性。

近日，东南大学医学院姚红红教授团队联合东南大学化学化工学院张袁健教授团队在Nature Communications发表研究文章“Fast and sensitive multivalent spatial pattern-recognition for circular RNA detection”，报道了一个智能四面体DNA流程（TDF）。该流程具有精确的空间模式识别特性，可快速、高灵敏度检测circRNA。研究团队验证了TDF检测临床样本中的circRNA水平以及追踪体内外源性circRNA的性能。值得关注的是，TDF可以在活细胞中直接可视化circRNA。TDF为检测生理和病理生理条件下的circRNA丰度提供了一种快速、灵敏的工具。

circRNA的精确分析对于推进生物学研究、加强精准医学和实现早期疾病诊断至关重要。研究团队受到章鱼进化出8条手臂的启发，采用多价空间模式识别特性，以提高捕获效率和对circRNA的结合亲和力。此外，研究团队此前发现circSCMH1在脑中高度表达，但在急性缺血性中风患者中显著下调，可作为缺血性中风的诊断和治疗生物标志物。因此，研究团队将circSCMH1作为模型靶点，开发了四面体DNA框架（TDF），以选择性识别和高亲和力捕获完整的circRNA。

TDF由三个功能组件组成：（1）三个目标序列，即circSCMH1的BSJ和另外两个剪接结，以增强结合亲和力，消除非特异性脱靶效应。（2）基于circSCMH1的结构，估计两个相邻目标位点之间可能的距离约为10-14 nm。因此，TDF设计被边长为37bp（≈12.6 nm），以三角形单元匹配circSCMH1三个靶序列的模式和间距。（3）识别circRNA三个靶向序列的三个探针位点被荧光团标记，但其荧光被与探针杂交的BHQ修饰的DNA（Q）猝灭。通过将这三个荧光团/猝灭器功能化探针在其边缘杂交，以形成几何匹配和靶向circSCMH1的多价TDF传感器，将TDF功能化以检测circSCMH1。

circRNA的探针识别最容易受到同源线性RNA序列的干扰，研究团队证实了TDF结合circRNA的高度特异性。进一步的快速DNA杂交动力学分析发现，在60秒内即可获得TDF的饱和信号，强调了多价空间模式识别的超强亲和力和对提高circRNA生物识别效率的重要性。同时，TDF不影响细胞活力，可表征脑卒中前后雄性小鼠体外神经元细胞circSCMH1的动态实时监测，以及小鼠脑切片中circSCMH1的灵敏快速原位成像。总体而言，TDF非常适合应用于各种细胞类型的组织切片，快速、灵敏的检测内源性circRNA。

图：TDF的研发与表征。

临床样本的生物学复杂性较高，与线性RNA相比，circRNA通常表现出较低的表达水平。因此，超灵敏和超快速检测临床样本中的circRNA对于其未来在诊断疾病和评估治疗效果中的应用是至关重要的。为此，研究团队评估了TDF检测临床样本中circRNA的可行性，结果表明TDF能够以超快速度以及优异的灵敏度和准确度直接检测急性缺血性脑卒中患者临床样本中的circRNA。在没有核酸扩增的情况下，TDF准确地检测到血浆样本中的circSCMH1。此外，TDF信号与qPCR的结果呈正相关，且TDF不需要额外的靶扩增步骤，具有简单、易于操作和多功能性的优点。

图：TDF检测来自临床样本的未扩增RNA中的circRNA。

除了在体外和体内系统中检测内源性circSCMH1都表现出高灵敏度和有效性外，TDF还可以在体内追踪细胞外囊泡递送至大脑的外源性circSCMH1。这种能力对于研究外源性引入的circRNA的行为和命运，利用潜在治疗应用的细胞外囊泡传递机制或研究由circRNA介导的细胞间通讯具有重要价值。

图：TDF在体内追踪细胞外囊泡传递的外源性circSCMH1。

该研究证明了TDF在体外和体内快速（仅需1分钟）检测circRNA的多功能应用。TDF不仅实现了内源性circRNAs的活细胞成像，与以前的方法相比，TDF的精确空间模式识别特性对circRNA的特异性识别也具有更高的灵敏度，能够超精确地检测不同样本中未扩增的circRNA。此外，TDF还实现了外源性circRNA的体内追踪，解决了追踪基于circRNA开发的核酸药物的体内行为的瓶颈问题。未来，研究团队将有可能开发用于多重circRNA成像的TDF方法，以探索多种circRNA在不同生物过程中的功能和机制。

论文原文：

Zhou, Z., Han, B., Wang, Y. et al. Fast and sensitive multivalent spatial pattern-recognition for circular RNA detection. Nat Commun 15, 10900 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-55364-x