近日，FDA发布了《循环肿瘤DNA用于治疗性实体瘤药物开发的行业指南（Use of Circulating  Tumor DNA for Curative-Intent Solid Tumor Drug Development Guidance for Industry）》，旨在为那些计划在新药申请（IND）下进行的临床试验中使用循环肿瘤DNA （ctDNA）作为生物标志物的药物研发申办者提供指导，和/或支持用于治疗早期实体瘤的药物和生物制品的上市批准。

早在2022年5月，FDA首先发布了该指南的草案，经过2年多的反馈收集和深入探讨，最终形成了此次发布的终版指南。该指南反映了FDA目前对药物开发和临床试验设计问题的思考，这些问题涉及在实体瘤的临床试验中使用ctDNA作为生物标志物。同时讨论了ctDNA分析和检测方法的标准化和一致性，特别关注了评估分子残留病（MRD）分析。需要注意的是，该指南的重点是将ctDNA用于早期实体瘤药物开发，仅作为监测疾病复发的体外诊断。同时，该指南不涉及ctDNA用于癌症的早期检测或癌症筛查，也不涉及ctDNA在转移性癌症中的应用。

一、背景

该指南首先概述了ctDNA背景信息及其在早期实体瘤诊疗中的作用。ctDNA作为一种生物标志物，在早期癌症中有许多潜在的监测和临床应用，可以帮助和加速药物开发。支持ctDNA临床有效性或临床应用的证据因实体瘤、患者群体和检测方式而异。ctDNA的数量因人而异，并与肿瘤类型、位置、分期、肿瘤负荷和对治疗的反应有关。将ctDNA终点纳入前瞻性随机临床试验对于进一步产生证据以支持ctDNA的监管和临床应用非常重要。但ctDNA的评估可能因实验室和检测技术而异，这可能导致不同的结果。检测的进一步标准化和协调有助于在监管环境中更好地使用ctDNA，并允许跨研究分析以验证ctDNA的使用。

二、ctDNA作为生物标志物在早期实体瘤临床试验中的发展

指南列举了ctDNA作为生物标志物在早期实体瘤临床试验中的四大应用发展：

1.患者筛选

对患者的血浆进行ctDNA检测，可以潜在地选择携带特定药物靶点的遗传或表观遗传改变的患者群体。如果组织不可用，ctDNA也可以用于辅助治疗患者分层，例如在用化放疗而不是手术进行治疗性治疗后。

ctDNA可用于患者选择，以检测基因组改变的临床试验资格标准。

如果一项试验同时招募了生物标志物阳性和生物标志物阴性人群，则ctDNA识别特定分子改变也可以用作分层因素。控制I型错误率的分级检测程序可以允许在目标治疗人群和生物标志物选择（ctDNA生物标志物阳性）亚组中检测多个有序终点。

由于ctDNA检测可能包括假阴性结果，ctDNA检测对临床目标变异的灵敏度应使用适当的检出限研究进行评估。如果可行，可能需要进行肿瘤检测，以确认ctDNA阴性结果。

2.MRD检测

在试验早期阶段，在明确的局部治疗和/或（新）辅助治疗后，残余的ctDNA是MRD的指示性指标。ctDNA MRD可以作为一种生物标志物，帮助识别高风险疾病和复发或死亡事件增加的患者。

手术或新辅助治疗后的ctDNA MRD检测可以确定生物标志物阳性人群的试验资格。

ctDNA MRD基线状态可作为ctDNA MRD阴性和阳性患者入组研究的分层因素。分级检测程序可用于检测目标治疗人群（包括ctDNA MRD阳性组和阴性组）以及ctDNA MRD阳性组。

ctDNA MRD可用于优化治疗方案，为高复发风险患者（即ctDNA MRD阳性）增加治疗，或为低复发风险患者（即ctDNA MRD阴性）降低治疗。试验设计可以包括对ctDNA MRD阳性患者的标准护理治疗中增加试验治疗的升级设计，或对ctDNA MRD阴性患者的降级设计。降级试验可以评估一种新疗法，这种疗法可能比目前的标准治疗方法毒性更小，减少治疗时间或剂量，或者完全取代标准治疗。临床试验应该是随机的。

MRD分析应具有高敏感性和阴性预测值（NPV），以支持治疗的降级，并具有高特异性和阳性预测值（PPV），以支持治疗的升级。

如果只给予辅助治疗，主要终点应该是无病生存期（DFS），如果给予新辅助治疗（有或没有辅助治疗），主要终点应该是无事件生存期（EFS），或总生存期（OS）。如果DFS或EFS是主要终点，根据预先指定的分析计划，应该没有损害OS的证据。

由于事件有限，不应对主要终点进行任何早期、中期疗效分析。可以考虑以后的中期分析，但这些分析应该在试验开始时预先指定，根据多次检测进行调整，并在数据成熟的合理点上进行设置。例如，预计大多数患者应该在进行任何中期分析之前完成治疗。

3.药物开发反应的衡量标准

ctDNA水平的变化可以用于早期临床试验，以帮助发现药物活性的信号，并可能帮助开发商制定药物研发计划。与ctDNA水平或清除率变化相关的初步信号可能为未来随机试验的设计提供信息，这些随机试验将ctDNA终点和时间到事件疗效的结果检测结合起来。

在临床药物开发的早期，ctDNA水平的变化可用于评估研究药物的抗肿瘤活性，无论是单独还是与影像学信息一起。

监测ctDNA水平变化可以提供相关的临床数据，这些数据可以与其他临床数据、相关的非临床数据和剂量-或暴露-反应关系结合使用，从而为后续临床试验选择最佳剂量。

FDA鼓励申办者除了支持新辅助治疗后的病理完全反应信息外，还开发关于ctDNA反应有效性的证据。

4.临床试验的早期终点

虽然目前还没有被证实可以使用，但是药物引起的ctDNA变化有可能被用作支持药物批准的早期终点。

ctDNA变化或ctDNA清除作为早期治疗性癌症试验的早期终点可能特别有用。与转移性癌症不同的是，最终局部治疗后的（新）辅助治疗中的临床试验不能使用基于影像的肿瘤结果（如总体缓解率）来衡量对试验药物治疗的反应。

纳入ctDNA终点的前瞻性随机临床试验的进一步数据需要支持ctDNA作为合理可能预测长期结果的终点（DFS/EFS/OS）。

在药物治疗前后收集ctDNA数据的试验也应收集长期结果数据，以表征ctDNA的减少或清除与长期结果之间的关系。

通常推荐ctDNA定量分析和多个检测时间点，可以实现更稳健的数据。

已经提出了各种统计标准来验证终点，并且经常使用元分析方法。

在试验水平上验证ctDNA相关性的适当元分析应只包括随机试验。申办者应与FDA讨论并提供任何拟议的元分析计划的细节，以验证ctDNA在特定环境中的使用。

三、ctDNA检测注意事项

在临床试验注意事项中，该指南指出，在用于临床试验之前，ctDNA分析应经过分析验证并具有足够的性能特征。开发用于肿瘤学临床试验的ctDNA检测的一个重要部分是标准化和统一的分析和方法。该部分侧重于MRD应用中的ctDNA检测方法的开发。

1.MRD检测类型

ctDNA MRD分析可以利用tumor-informed方法（肿瘤知情分析）、tumor-naïve方法（肿瘤未知情分析）或较小的候选基因和/或多组学生物标志物，每种方法都有自己的优势和局限性。由于所使用的MRD应用程序和技术是新颖的，所选择的方法应该考虑预期用途和用户需求。这些检测需要有足够的性能，以达到必要的灵敏度和特异性，以支持预期的用途。

Tumor-informed方法是通过肿瘤测序，然后选择一组变异来追踪。Tumor-informed panel在肿瘤取样或恢复到野生型状态后可能无法检测到新出现的突变。

该方法的一个优点是更高的特异性；局限性包括肿瘤检测和ctDNA panel创建之间的滞后时间，敏感性和特异性可能取决于临床截点和分析敏感性，以及所检测的tumor-informed靶点数量；Tumor-informed panel选择变异的可靠性很重要。与来自突变负荷较低和变异特征不明显的肿瘤panel相比，来自具有较高肿瘤突变负荷和高度特征性变异（即突变热点）的panel可能更可靠。

Tumor-naïve panel是不通过测序，利用已知原发肿瘤中存在的特定突变来构建的通用panel。该方法使用利用NGS来检测MRD。

该方法的优点是周转时间更快；局限性包括ctDNA panel未涵盖肿瘤的特异性生物标志物。为了解使用这种技术可追踪的患者比例，还需要对panel进行额外的表征；全基因组测序（WGS）可能以tumor-naïve方式使用。这将允许使用各种生物标志物，包括但不限于突变、表观遗传改变（例如甲基化）或ctDNA片段组学分析，来捕获肿瘤来源的ctDNA信号。

候选基因panel上的多个生物标志物可以帮助确保MRD检测能够发挥其功能，即使发生额外的细胞遗传学变化。

2.取样注意事项

与临床试验设计和预期使用患者群体相关的取样因素应该考虑在内。

ctDNA的脱落释放受肿瘤的组织学、分级、分期和大小的影响，因此ctDNA检测的时机应与FDA讨论，并应由检测的性能特征、疾病特征和肿瘤生物学来支持。

应选择并于预先指定一个（或多个）设定的时间点用于研究登记。

如果申办者希望使用多个ctDNA时间点来确定资格（例如，筛选模式评估早期发现复发时的干预是否会影响结果），这应该得到科学数据/理由的支持。可以探索基于不同时间点的敏感性分析（但应预先确定和讨论）。

ctDNA样本采集的时间在各个研究组中应相同。

应收集基线治疗前的血液样本，以考虑肿瘤脱落率变化对分析性能的影响。此外，该样本将可以用于治疗后样本的解释。

研究中的所有站点都应遵循样本收集、储存、加工和处理的标准化协议。应控制可能影响背景DNA水平和ctDNA水平的分析前因素，因为它们可能影响检测的敏感性和特异性。

3.市场应用中的检测分析验证考虑

分析验证可确保该分析方法检测预期肿瘤类型中的一种或多种待测分析物。ctDNA MRD检测应进行分析验证，以确定检测的性能特征。验证研究应在检测的敏感性、特异性、准确性、精密度和其他相关性能特征方面是可接受的，使用指定的技术方案，其中可能包括样本采集、处理和储存程序。验证研究的接受标准应充分证明支持其临床应用。

MRD检测验证应包括整个检测系统，从样本采集（例如，将用于最终上市检测的特定采集管中的血液采集）到检测结果输出，包括确定阳性患者与阴性患者的检测阈值（cut-off值）。检测阈值应预先指定并优化，以最大限度地减少基于预期用途临床环境的误诊。此外，应考虑从患者检测样本中观察到的结果分布，以确定基于检测不精确的误诊可能性。对于不使用阈值的检测，应证明阳性结果报告高于检测噪声，并应提供证据证明低于检测限报告的阳性结果是准确的。

应建立预定义的检测cut-off值和特定时间点，以优化临床试验使用的检测灵敏度和特异性。分析性能应稳健，以准确、可重复性地检测MRD阳性。

MRD检测的验证方法将取决于MRD检测的类型。对于基于NGS的tumor-naïve MRD panel，将需要对固定panel进行验证；对于基于NGS的tumor informed个性化MRD panel，每个患者的检测内容不同，因此将基于每个个性化检测进行验证。该指南建议具有代表性的个性化检测验证应包括不同的变异类型、类别、数量和在预期使用人群中的分布。支持器械上市申请的验证策略应与CDRH/FDA讨论。

建议将临床样本用于关键分析验证研究，如确认检测限（LoD）、分析精度、分析准确性和分析输入研究。为了分析的准确性，验证研究应包括关键临床试验的样本。在一些分析验证研究中，由于需要大量的样本，临床样本可能会被人造样本所补充。一般来说，当在分析验证研究中使用人造样本时，应证明人造样本和临床样本之间的功能等效性，并提供理由。在整个检测范围内，变异的可检出性在人造和临床标本之间应是相同的。

对于固定panel，携带特定改变的细胞系（即掺入适当基质的细胞系DNA）可以用作人造样本。对于个性化panel，应该开发基于早期临床研究数据的代表变异数量和类型分布的细胞系。

应使用检测范围内的样本来证明检测精度，包括检测cut-off值的样本和具有最低分析物要求的样本。

应开发一套合适的参考材料，以便在多种MRD分析中进行比较。可能需要与标准组织（例如，美国国家标准与技术研究所、世界卫生组织）和多个利益相关方合作。

申办者应通过Q-Submission与CDRH讨论分析验证计划。

四、研究检测设备的考虑

在试验中用于入组或治疗决策的试验性ctDNA设备受FDA的试验性设备豁免（IDE）法规以及21 CFR第50和56部分的约束。

申办者是否需要提交IDE申请取决于试验中使用的器械是否被视为重大风险（SR）、非重大风险（NSR）或豁免。

申办者可以通过CDRH的Q-submission程序提交研究风险认定预提交文件。

•申办者还可以通过可选的简化提交流程，为新IND的肿瘤学试验中的研究器械寻求风险认定。