导读

急性髓系白血病（AML）是一种造血干细胞恶性疾病，现有新型化疗药物和靶向治疗能够使多数AML患者实现细胞形态学完全缓解（CR），但大约50%的患者最终会复发。因此，监测微小残留疾病（MRD）在定量评估AML复发中起着重要作用，但分子MRD分析的应用主要局限于诊断为基因融合和NPM1突变的患者。目前亟需开发高灵敏度和特异性的MRD检测方法来预测适用于普通AML患者的临床结果，无论其遗传原因如何。

近日，首都医科大学药学院吴若嘉教授团队联合北京医院刘辉团队和北京大学戴鹏团队在Nature Communications发表了题为“Longitudinal ultra-sensitive mutation burden sequencing for precise minimal residual disease assessment in AML”的文章。研究团队开发了一种纵向超灵敏突变负荷（UMB）监测策略，通过使用检测限低于0.01%变异等位基因频率（VAF）的定量阻断剂置换扩增（Quantitative Blocker Displacement Amplification，QBDA）测序panel，可精准地分析具有不同基因异常类型AML患者的MRD。复发累积发生率（CIR）分析显示，UMB监测策略可早期预测复发：在至少有2个CR样本时间点的20名患者中，危险比（HR）为14.8；对于至少有1个CR样本时间点的所有患者，HR为11.6。当预测CR时间点2后30周内的复发时，AUC为0.98。综上，UMB监测策略是AML患者预后评估和复发检测的潜在有效新方法。  

文章发表在Nature Communications

1.使用UMB定量panel分析AML骨髓抽吸物样本中的突变

UMB定义为在所选基因组区域内检测到的所有突变的VAF之和，癌症细胞比正常细胞的基因组不稳定性更高，因此假设UMB也更高。在骨髓抽吸物样本中，达到CR后白血病细胞计数降至比诊断时更低的值，导致UMB减少。对于复发患者，白血病细胞在复发前会增加；而对于持续CR的患者，CR期间白血病细胞的数量保持稳定或下降。因此，CR期间UMB升高预计是复发的前兆。

由于CR期间的MRD起始水平极低（<0.01%VAF），研究团队使用QBDA技术来量化各种突变，包括单碱基替换和InDel。QBDA技术能够将独特分子标识符（UMI）与抑制探针置换扩增（BDA）相结合用于突变富集，通过低深度测序实现免校准的精确VAF定量，仅在23,000×测序深度就能精确定量低于0.01%VAF的突变

为有效检测与AML相关的突变，研究团队基于My Cancer Genome数据库和COSMIC数据库，合理选择了AML中常见的突变热点基因组区域，设计了一个QBDA panel，覆盖22个基因的28个热点区域中共738个核苷酸位点。由于FLT3-ITD突变范围较大，QBDA无法轻松检测，为此使用PCR扩增和标准NGS检测FLT3-ITD位点。

接下来，研究团队使用AML QBDA和FLT3-ITD panel在诊断、复发（仅在复发病例中）和至少一个CR时间点检测了从骨髓抽吸物样本中提取的gDNA，对24例AML病例的83个样本进行测序。结果显示，共检测到221个突变（VAF范围在0.0031%-11%之间），由于常规检测方法的局限性，这些突变没有得到详细研究；但使用QBDA能够在所有样本中检测到VAF≥0.001%以上的所有突变。

研究团队对所有诊断、 CR和复发样本进行了UMB分析，发现所有病例在诊断和复发时的平均UMB明显高于CR期间。研究团队计算了每个样本中突变VAF≤0.1%的总和，并分析了其在UMB中的比例。中位数分析显示，CR样本中VAF≤0.1%的低频突变比例较高；41%的CR样本没有VAF>0.1%的突变。

图1. 使用热点QBDA NGS panel定量AML骨髓抽吸物样本中的低VAF突变和UMB。

2. 基于UMB分析预测AM患者复发

研究团队对在CR期至少两个不同时间点采集样本（≥2个）的20例患者进行CIR分析；根据UMB在CR期间的变化，将AML患者分为UMB+（CR期间UMB增加）和UMB-（CR期间UMB减少或不变）两组。结果显示，UMB+组与UMB-组之间CR 持续时间存在显著差异，UMB+组中位复发时间比UMB−组短548天 。使用ROC曲线分析预测CR时间点2之后30周内复发，AUC为0.98，表明使用不同CR时间点UMB之间的比值能预测复发时间。

此外，研究团队使用>0.01%、>0.1%或>1%突变计算UMB，模拟了不同VAF LoD下各种检测技术的实验结果，发现精准定量到低于0.01% VAF的超低丰度突变，对基于UMB的复发预测至关重要；通过连续监测UMB，可以捕捉到复发的迹象并指导及时治疗。除在相对较短的时间内预测复发外，使用UMB还可对更多纵向样本进行长期MRD监测。

图2. UMB对AML患者复发的早期预测。

3. 诊断时不同遗传异常类型病例的MRD检测

研究团队定义了双阴性AML病例为NPM1突变和基因融合均为非阳性，传统方法难以分析其MRD，而UMB方法则准确预测了这些病例的复发。CIR分析显示，UMB+与UMB-组的CR持续时间差异显著，中位数差异天数为553天；使用调整后的UMB比值预测30周内是否复发的ROC AUC为1.00。在双阴性病例中，50%在诊断时检测到>0.1%VAF致病性突变，这些突变可作为MRD的生物标志物。

图3. 不同突变特征的AML病例中MRD的评估。

4. 使用不同大小的panel进行UMB分析

研究团队分析了UMB panel中包含的基因数量对复发预测的影响，根据MCG数据库中AML基因突变频率对22个基因进行排序。结果显示，前11个基因的平均突变率高于后11个，表明MCG排名高的基因可能更容易在AML中发生突变，因此计算UMB时采用AML相关基因热点可能更有益，这些位点能更有效地捕捉突变。

接下来，研究团队使用不同panel大小计算UMB，发现在CIR分析中UMB+与UMB-的HR与基因数量呈正相关，基因数量≥15个时，CIR分析的p<0.05。研究团队还使用不同大小的UMB panel对CR时间点2后30周内的复发进行了预测，ROC AUC也与基因数量呈正相关，当基因数量≥10时ROC AUC>0.80。总体而言，panel越大预测越准确，最小可行panel大小约为15个基因。

图4. 使用突变子集进行基于UMB的复发分析。

5. 基于UMB的AML风险评估

目前对AML风险评估的共识是2022年ELN风险分类，其根据患者在初诊时的遗传学特征将患者分为三个风险类别：良好、中危和不良；该研究中这三个风险类别占比分别为16.7%、66.7%和16.7%。对于被分到中危组的病例，特别需要一种有效的MRD监测方法；为证明UMB适用于这些患者，研究团队专门对ELN中危组进行了UMB分析。CIR分析显示，UMB+组与UMB-组的HR为93.5，两组之间CR持续时间的中位数差异为525天；使用bCR2/bCR1预测CR时间点2后30周内是否会发生复发，ROC AUC为1.0。上述结果表明，基于UMB的风险评估可用于及时指导高风险病例的医疗干预。

该研究中62.5%的患者接受了低甲基化药物联合Venetoclax的治疗，为证明接受联合疗法病例的兼容性，研究团队对低甲基化药物和Venetoclax 组进行了UMB分析。在CIR分析中，UMB+组有显著影响，HR为8.9，两组CR持续时间的中位数差异为539天。使用bCR2/bCR1预测CR时间点2后30 周内是否会复发，ROC AUC为0.97。总之，该研究证明了UMB可作为辅助诊断，用于监测治疗结果，并评估不同基因异常类型、ELN风险组别或治疗方法的病例的疾病进展情况。

图5. 基于UMB的复发预测适用于ELN中风险组或接受靶向治疗的患者。

综上所述，研究团队应用超低丰度突变定量测序技术，开发了基于UMB的MRD监测策略，并验证了该方法在AML不同初始突变类型、风险组别或治疗方法的病例中均对复发有良好的预测效果。与基于流式细胞术或特定基因变异检测的传统方法相比，该方法可覆盖的患者群体更广，有望为MRD的精确评估提供一种灵敏且通用的新策略。

论文原文：

Wu, Y., Zhang, S., Feng, R. et al. Longitudinal ultra-sensitive mutation burden sequencing for precise minimal residual disease assessment in AML. Nat Commun 15, 9853 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54254-6