生命是一个又一个的程序。有些程序很小，功能也很简单，大肠杆菌像是微信小游戏；有些程序很大，拥有精美的画面和复杂的功能，智人就像是生命中的3A大作。生命的性状是由一套叫做基因的程序定义的，这些程序决定了一个生命是什么样子，人没有尾巴而猴子有，是因为猴子基因里编码尾巴得到了运行。我们之所以是现在这个样子，是因为我们的基因里有这样的程序，而且这些程序被正确的运行。

和程序一样，基因也会存在一些错误指令（bug），但和电脑程序不同的是，基因无法识别一个指令是正确的还是错误的，更不会报错，而是一股脑的执行下去，直至崩溃。错误的程序在身体中不断的执行，就会引发更大的危机——疾病。

如果先天遗传拷贝下来的程序中含有错误的指令，那么机体也会产生错误的结果。例如错误编码了的视锥细胞会无法正确的识别颜色而导致色盲，从而影响正常的生活。而即使先天的程序正确，在我们生活的过程中也会遇到很多的危险，比如强紫外线照射与病毒感染，这些情况会对细胞中的基因产生影响而导致疾病的发生，例如HPV（人体乳头瘤病毒）感染后诱发细胞癌变。

有的基因疾病并不会产生严重的影响，可以通过后天进行矫正，比如唇裂就可以通过手术的方式改善。然而很多基因疾病并不是简单的改变我们的外观，而会深入的影响到我们身体内在的运行。所以，我们需要找到一个方法，去更正基因程序中的错误（debug），删除掉错误的指令或者补全缺失的组件，让生命回归到平常的状态。

现在，我们可以通过RNA（核糖核酸）干扰等方式在不改变基因的条件下改变生命程序的执行，但是科学家并不满足这种更加临时的方法，而希望找到能一劳永逸治疗手段——通过编辑基因本身，来改变个体甚至下一代的特征。

1962年， Waclaw Szybalski的实验发现鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷的细胞（HGPRT-），可以通过导入编码鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷的外源基因，让细胞获得转移鸟嘌呤磷酸核糖的能力。这一发现意味着细胞内由基因缺失带来的缺陷能够通过导入外源基因修复。

一些病毒能够将基因导入宿主体内这一特性激发了第一例基因治疗尝试：Shope乳头瘤病毒通过导入目的基因进入细胞，成功修复了细胞的尿素代谢缺陷。在上世纪90年代，一种以逆转录病毒为载体的基因治疗方法被临床用于治疗腺苷脱氨酶缺失（ADA），一位因ADA患有严重自身免疫疾病的患者因此得以治愈。2020年，在Clinical trials注册的正在进行的基因疗法实验多达896项，包括了先天基因缺陷疾病、心血管疾病、神经退化疾病以及癌症等疾病的治疗，基因疗法很快将从象牙塔走到寻常百姓家。

基因的“魔力剪刀”

仅仅是导入新基因并不能完全解决问题：有相当一部分的基因疾病并不是由基因缺失，而是由于错误的基因存在引起的。因此，我们不能满足于导入新的基因，而需要能够对现有基因进行删除或者直接编辑成我们需要的编码。

在基因编辑技术的历史中，微生物是我们的宝藏。相比于哺乳动物需要对付包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等不同种类的病原体，作为单细胞动物的细菌只需要对付一种敌人：病毒。病毒并不具备独立生存的能力，它需要将自己的遗传信息侵入宿主细胞内，借助宿主细胞的材料和工具复制自己，最终离开宿主。由于大多数的病毒的遗传物质都是核酸，细菌想到了一个巧妙的方式：如果有办法识别入侵的核酸而不损伤自己的核酸，那么就可以阻止病毒的复制，保护自己。

这样的免疫机制同样给基因编辑技术带来可能：它能够识别特定的核酸序列并在特定位点切割基因，就好像给编辑器增加了搜索插件，要找到我们的目标就容易很多了。

早在上世纪80年代，科学家就在微生物中发现了限制性核酸内切酶（限制酶），通常它能够识别4~8bp（碱基对）的核酸并在特定的位置进行切割。我们再辅以DNA连接酶这个胶水，我们就可以将我们需要编辑的基因剪开，并粘上我们所需要的基因。在这一套重要的工具被发现之后，人类也大胆的开始了基因编辑的历程。

但是这套工具依然有着许多缺点。对于限制酶来说，它虽然能够识别数个碱基对，但是这些碱基对并不够精确，也不够特别，而且存在严重的偏向性。这就像在一本书里去找一个名字叫“斯基”的人，在一本中国小说里几乎不能找到这样一个人，而在一本俄罗斯小说里却可以找到上百个“斯基”，也不知道哪一个才是你真正需要找的。而DNA连接酶也并没有很强的特异性，它像一个淘气的小孩会把所有可以粘连的基因都粘在一起：所以有时候我们所需要的基因能够正确的连接在一起，然而也有大量的基因是错误连接的。

因为这些缺点，限制酶-DNA连接酶这一技术更多的停留在了实验室中，而并没有应用到临床：人的基因可是非常复杂且精密的，不可以让淘气孩子胡闹。

淘气的孩子并不意味着不能长大，如果我们稍加教育，就能让限制酶变得更加聪明。TALEN（转录激活样效应因子核酸酶）与ZFN（锌指核酸酶）就是长大了一些的孩子，他们在限制酶特异性识别的基础上，增加了序列引导，能够识别14~40bp的序列。这样，原本只会寻找“斯基”的限制酶能够被引导着去寻找“彼得·伊里奇·柴可夫斯基”，这样就能很容易的找到一位俄国音乐巨匠，而不是迷失在茫茫人海之中了。

虽然TALEN 和ZFN能够更加特异性的识别基因序列并进行编辑，但是它依旧依赖于限制酶的识别：当我们使用识别“斯基”的内切酶是无法找到“列夫·尼古拉耶维奇·托尔斯泰”，而必须合成能够识别“斯泰”的限制酶并加以修饰。这意味着，每一次我们要寻找一个特异的序列，我们都需要找到对应的内切酶，如果并不存在能够识别“雨果”的内切酶，我们也就找不到“维克多·马里·雨果”了。虽然我们现在能够合成识别特定位置的内切酶，但是过程过于繁琐，耗时也更长。

从核酸内切酶到CRISPR

与TALEN同一时期发现的CRISPR（短回文重复序列）系统则用另外的方式巧妙的回答了这一难题。

CRISPR其实是细菌的“黑名单”：当有病毒（噬菌体）入侵细菌后，细菌的Cas（CRISPR相关）核酸酶系统能够切割入侵的病毒，使得病毒失去活性。与此同时，Cas系统还能够将一段病毒的特异性序列截取并存档到自己的基因中。等到下一次病毒入侵之后，Cas能够通过之前存档在CRISPR区域的识别序列转录成crRNA（CRISPR RNA）识别入侵的病毒，更快的对病毒核酸进行降解，抵御病毒的入侵。

由于CRISPR/Cas系统中的核酸酶的PAM（原间隔物模块，通常只有3个bp）识别更加广泛，而用于引导Cas酶的sgRNA（单向导RNA，由crRNA生成）能够很便捷的合成，我们能够将这一套“识别-剪切”系统组合，就能够更加精确且广泛的对基因进行剪切。

光是有剪切可不行，我们需要的编辑还需要粘贴才能够完成，而我们自身体内的基因修复机制就可以完成这个工作，不需要额外外源的蛋白参与。

我们的基因修复系统像是一个抄作业的小学生。当有基因损伤时，就像作业被撕掉了一页，基因修复机制就会尝试找到一本一模一样的作业，把另一本完好的作业抄到损伤的页码中，完成对基因的修复，这个过程叫做同源定向修复（HMR）；而如果没能找到一份同样的作业时，他会自由发挥，在损伤的位点胡乱的添加核酸，从而导致基因移码，这样作业就没有办法被老师看懂了，这个过程叫做非同源末端连接（NHEJ）。

聪明的你应该猜到了：如果我们将特定位点的作业撕掉，并给基因修复系统一本我们想要的“正确作业”，那么基因修复系统就会按照我们提供的要求将基因写在我们需要的位置，从而完成基因编辑。因此，在设计CRISPR/Cas系统的时候，除了考虑识别序列和Cas9工作基因的同时也可以添加具有指导作用的同源基因，欺骗HDR用我们提供的基因取代原有的基因。我们也能在不打开基因的条件下，通过CRISPR/Cas系统对基因的单一位点进行编辑：递送一个更正答案的贴纸而不是剪刀，粘在作业上，通过化学反应直接改变核苷酸，这样能够更加简便精确的对单一位点突变进行修正，同时避免了打乱基因组的问题。

到这里，我们就有了有效的基因编辑手段，我们已经准备好了识别暑假作业页码的引导序列，撕掉作业的Cas酶以及以假乱真的参考作业同源序列。这一方法更加精准的识别了我们所需要的核酸位点，避免由于过于广谱的靶点导致重要的基因被错误编辑，而简便的原理和低廉的成本也让这一技术大规模商业化成为了可能。

在核酸是生命信息的载体这一观点被提出的这半个多世纪里，科学家一直致力于通过解码和编辑基因来对抗由于基因带来的缺陷。现在，我们掌握了CRISPR-cas9这一技术，它将作为一颗颗承载希望的子弹，对基因造成的疾病宣战。

CRISPR等基因编辑工具的成熟、DNA测序和合成的成本快速降低，让基因编辑的技术门槛大幅下降。基因编辑技术推动了合成生物学的跳跃式发展，国内如蓝晶微生物等合成生物学公司，通过将生物技术与数据处理相结合，试图解决新分子和新材料问题，长期来看将助力碳中和及环保事业的发展。

参考来源：

[1]Gene therapy and gene correction: targets, progress, and challenges for treating human diseases. (2020). Gene Therapy. https://doi.org/10.1038/s41434-020-00197-8

[2]The royal Swedish academy of science. A TOOL FOR GENOME EDITING. (2020).

[3]Stoddard, B. (2005). Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics, 38(1), 49–95. https://doi.org/10.1017/S0033583505004063

[4]癌图腾. 基因组编辑三大利器：TALEN、ZFN和CRISPR/Cas. 百度百科. 2016-11

[5]Baker, M. (2012). Gene-editing nucleases. Nature Methods, 9(1), 23–26. https://doi.org/10.1038/nmeth.1807

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