帕金森病患者外泌体乙酰胆碱酯酶可作为生物标志物

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帕 金 森 病（PD）

帕金森病（PD）的病理生理学特征之一是在大脑中形成路易小体，主要由α-突触核蛋白（α-syn）等不溶性聚集物组成。因此，α-syn作为PD疾病进展的潜在生物标志物和指标已被广泛研究.。

但缺乏可靠的PD生物流体标志物限制了对疾病进展或治疗反应的监测。越来越多的证据表明帕金森病患者黑质纹状体多巴胺能系统的产生与胆碱能去神经支配之间存在关联。外泌体是由多种细胞类型产生的细胞外小泡，含有多种分子成分，如蛋白质、脂类和RNA。

近年来，外泌体生物标志物被研究用于探索神经退行性疾病病理和诊断方法。来自韩国首尔退伍军人健康服务医疗中心的研究团队同时检测了乙酰胆碱酯酶（AChE）和α-syn的染色体标记，用超速离心法从PD患者和健康对照组（HC）的血浆样本中分离出外泌体，测定外泌体AChE活性与α-syn水平，探讨其与临床参数及其生物标志物的相关性。

实 验 结 果

1、参与者人口统计学和临床特征见表1所示。

组间存在性别差异，各组间MMSE评分无差异。所有PD患者均行FP-CIT PET检查；所有患者都表现为多巴胺转运活性降低。在HC组，7人接受FP-CIT PET检查。

表1 参与者人口统计学和临床特征

2、临床标本血浆外泌体生物标志物分析

通过超速离心分离外泌体，通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析可视化来证实（图1A）。通过纳米颗粒跟踪分析，外泌体约为140 nm（图1B）。Western Blot显示，外泌体在 Alix中富集，但在GM130中不富集（图1C）。

在PD和HC之间未发现外泌体大小和浓度的差异。分离的外泌体中的蛋白质总量可能因个体而异；因此测量了总的外泌体蛋白含量，并将其用于两种生物标志物的标准化。总外泌体蛋白水平与其浓度和乙酰胆碱酯酶活性高度相关。

图1 超速离心法分离的外泌体的特性

外泌体α-syn浓度在两组之间没有差异（图2A）。与HC组（4.7%）相比，PD组外泌体AChE活性显著降低（3.9%）（图2B）。ROC曲线分析显示，外泌体酶活性在PD诊断中表现为中等水平（图2C）。当临界值为4.05时，敏感性和特异性分别为61.8%和79.3%。

图2 外泌体生物标记物评估

3、外体AChE活性与PD进展的关系

接下来，作者分析了帕金森病患者外体AChE活性与疾病严重程度之间的相关性，以探讨其临床意义。病程与染色体AChE活性呈中度负相关(图3C）。MMSE评分和AChE抑制剂（包括多奈哌齐、加兰他明）与体外活动无显著相关性（图3D，E）。

图3 外源性乙酰胆碱酯酶活性散点图和临床数据

讨  论

研究表明，PD组较HC组外泌体乙酰胆碱酯酶活性显著降低。此外，外泌体AChE活性与疾病严重程度呈显著负相关。以往的研究通过组织病理学和分子成像检查了帕金森病人的胆碱能缺陷。

据报道，帕金森病患者的足前核胆碱能神经元数量减少，PET研究显示，帕金森病和帕金森病合并痴呆患者的枕中皮质胆碱能神经存在功能丧失。

综上所述，这些研究表明帕金森病患者中枢和外周神经系统存在胆碱能功能障碍，这支持了本研究中发现的外泌体乙酰胆碱酯酶活性的降低，其与疾病严重程度的密切联系突出了乙酰胆碱酯酶在帕金森病病理生理学中的重要性。

外泌体AChE活性是PD的单一诊断标志物，它可能具有进一步阐明PD病理生理学的潜力，但帕金森病患者AChE活性降低的原因仍不清楚。

一种假说认为，外泌体乙酰胆碱酯酶的产生和分泌减少与α-syn同步诱发细胞凋亡和神经元死亡。另一种假说认为是乙酰胆碱（ACh）和多巴胺（DA）之间存在平衡，这种平衡是运动控制的主要特点。PD病理学中DA缺乏可触发动力学中平衡的严重倾斜，导致运动和认知障碍的产生，以及胆碱能系统失衡。

在目前的研究中，可以提出假设，通过DA的消耗，DA和ACh之间的不平衡加剧了AchE活性的降低。

该研究存在一定的局限性，实验对象是从数量有限，并且存在性别差异，因此，研究应该扩大样本量和平衡性别差异。外泌体从神经元、血细胞和上皮细胞等细胞中释放，没有提取器官特异性来源的外泌体，因此，后续研究应优先考虑分离神经元衍生的外泌体来研究乙酰胆碱酯酶的活性。

总而言之，该研究证实PD患者AChE活性较健康组低，且PD组AChE活性与疾病严重程度呈显著负相关。这些结果提示血浆外泌体AChE可以作为一种监测疾病进展的生物标志物，在PD的发生、发展中起着重要作用。胞外体酶活性表现出中等的诊断性能，应用先进的胞外体分离技术可以提高诊断性能，并有利于开发诊断和治疗工具。