自2011年美国FDA批准CTLA-4抗体ipilimumab用于治疗转移性黑色素瘤以来，免疫检查点抑制剂(ICIs)显著改善了多种转移性和难治性癌症患者的预后。不过，目前仅有一小部分晚期癌症患者可在接受免疫检查点抑制剂治疗后获得长久的生存益处，大部分患者并不响应这类抗癌药物，且许多最初响应免疫检查点抑制剂的患者在随访中病情会再次进展。

       从机制上来说，包括CTLA-4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体在内的免疫检查点抑制剂作用于适应性免疫系统，通过阻断T细胞抑制通路来促进效应T细胞激活，进而增强抗肿瘤免疫反应。因免疫检查点抑制剂单药治疗响应率有限，近几年，科学家们一直在寻找扩大免疫疗法受益人群的方法。除了开发众所周知的基于免疫检查点抑制剂的联合治疗，如将不同免疫检查点抑制剂进行联合，或将免疫检查点抑制剂与T细胞共刺激分子或其它免疫刺激性受体激动剂进行联合（如pembrolizumab联合4-IBB激动剂PF-05082566、nivolumab联合IL-15超激动剂ALT-803），一些团队也在研究靶向免疫系统另一重要分支——先天免疫系统的药物。

       先天免疫系统是抵御感染和恶性细胞转化的第一道非特异性防线。单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及自然杀伤(NK)细胞均属于先天免疫系统细胞，其中，前三种细胞起抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APCs）的作用。而APCs通过吞噬作用（phagocytosis）吞没肿瘤细胞的能力是连接先天免疫和适应性免疫不可或缺的桥梁。

图1 肿瘤细胞吞噬作用调节（图片来源：Nature Reviews Cancer ）

      吞噬作用是一个多步骤的细胞过程，包括靶细胞识别、细胞吞噬和溶酶体消化，受靶细胞和吞噬细胞（这类细胞在肿瘤细胞免疫监测中起着重要作用）之间的受体-配体（即检查点）相互作用的调节(图1)。对于健康的正常组织和细胞来说，它们天生具有表达抗吞噬分子的能力，从而避免被吞噬细胞清除。然而，令人头疼的癌细胞也学会了相似的机制，并且相比正常细胞更依赖于这种机制。不过，基于对癌细胞躲避免疫攻击的这种途径的认知，科学家们认为，靶向调节吞噬作用的检查点（简称吞噬作用检查点，如CD47-SIRPα）可能提供了一条开发癌症免疫疗法的新途径。

图片来源：Nature Reviews Cancer

       8月28日，最新发表在Nature Reviews Cancer 上的一篇综述中[1]，来自美国希望之城综合癌症中心等机构的6位科学家详细介绍了过去20年在识别吞噬作用检查点方面取得的进展（图2），以及支持在癌症治疗中使用吞噬作用检查点阻断的临床前和早期临床证据。同时，文章讨论了阻断吞噬作用检查点后调控先天和适应性抗肿瘤免疫反应的机制，并强调如何桥接免疫系统的这两个分支来是产生最佳抗肿瘤免疫力的关键。

图2 癌症领域吞噬作用检查点阻断发展历史（图片来源：Nature Reviews Cancer ）

       一、吞噬作用检查点

       CD47-SIRPα轴是首个被发现的肿瘤吞噬作用检查点，其它参与调节肿瘤细胞吞噬作用清除逃逸的检查点还包括PD-1-PD-L1轴、MHC-I-LILRB1轴（图1、图2）。

       CD47-SIRPα轴

       SIRPα全称为signal-regulatory protein α，是SIRP家族的第一个成员，于20世纪90年代末被鉴定出，表达在髓细胞上，包括所有类型的巨噬细胞。CD47与SIRPα的相互作用在1999年首次被发现[2]，之后大量研究证实，CD47在正常细胞表面广泛表达，通过与巨噬细胞表面的SIRPα结合，释放一种“别吃我”的信号，从而保护健康细胞不被巨噬细胞“吃掉”。而癌细胞也学会了这一机制：在表面过量表达CD47，使巨噬细胞把它们当作“正常细胞”，从而逃避巨噬细胞介导的吞噬攻击。

       PD-1-PD-L1轴

       PD-1也称为CD279，于1992年首次被发现，属于B7-CD28超家族，在多种被激活的免疫细胞中被诱导表达，是T细胞耗竭（功能障碍）的标志物。目前，PD-1有两种已知配体，即PD-L1(也称为CD274和B7-H1)和PD-L2(也称为CD273和B7-DC)，都属于B7家族。尽管传统上认为PD-1-PD-L1轴是T细胞（适应性）免疫检查点，但2017年的一项研究显示，PD-1-PD-L1轴在调节肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)吞噬能力方面发挥了新的作用，也属于先天免疫检查点。该研究发现，来自早期人类和小鼠肿瘤中的TAMs与来自正常组织（如脾脏和外周血）的单核细胞或巨噬细胞相似，表达最低水平的PD-1，但随着肿瘤的生长，PD-1在TAMs中的表达呈指数级增加[3]。从表型上看，大多数PD-1+ TAMs为M2样巨噬细胞，这类巨噬细胞是晚期小鼠和人类结肠癌的主要巨噬细胞群[4]，其对肿瘤细胞的吞噬能力弱于PD-1-TAMs。研究还证实，使用PD-1抗体或PD-L1阻断剂扰乱PD-1-PD-L1轴可导致缺乏T细胞、B细胞和NK细胞但仍保留功能巨噬细胞的小鼠产生抗肿瘤反应。此外，敲除肿瘤细胞表达的PD-L1可显著增加PD-1+ TAMs对肿瘤细胞的吞噬作用。这些发现有力地支持了“癌细胞上的PD-L1表达可使其逃避巨噬细胞介导的吞噬作用”以及“阻断PD-1-PD-L1轴可能会同时诱导吞噬细胞和T细胞介导的抗肿瘤免疫”这两个观点。

      MHC-I-LILRB1轴

      2018年，有报道证实[5]，癌细胞上MHC-I的表达与它们抵抗吞噬作用有关，背后的机制是MHC-I与巨噬细胞上的LILRB1发挥了作用。

      LILRB1全称为leukocyte immunoglobulin-like receptor 1，属于LILBR家族，可在广泛的组织中表达（如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、某些NK细胞、T细胞亚群、B细胞等），在TAMs上的表达也尤为丰富。上述研究还证实[5]，通过基因操作破坏MHC-I-LILRB1相互作用可增加癌细胞在体内和体外对吞噬清除的易感性。

      二、吞噬作用激活途径

      在许多癌症中，恶性肿瘤细胞比正常细胞表达的抗吞噬（anti-phagocytosis）信号水平更高，这可能是为了抗衡促吞噬（pro-phagocytosis）信号（如calreticulin、SLAMF7以及肿瘤相关新抗原）表达的增加（图1）。

      Calreticulin

      Calreticulin即钙网蛋白，被证明可通过多种机制诱导吞噬作用以及下游免疫反应，可由靶细胞或巨噬细胞产生来发挥这些功能。已有大量证据显示，钙网蛋白是肿瘤中主要的促吞噬信号，这些研究强调了其对通过调节先天免疫系统清除癌细胞的重要性。

      SLAMF7和MAC1

      SLAM家族由9个受体组成，其中7个受体在巨噬细胞中表达，包括CD48、T淋巴细胞表面抗原Ly-9、CD244、CD84、SLAMF7(也称为CD319)、SLAMF8和SLAMF9。在癌症中，SLAMF7被认为是一种假定的促吞噬信号，可与表达在许多先天免疫细胞（包括巨噬细胞）中的巨噬细胞-1抗原(MAC1，一种由整合素CD11b和CD18组成的异二聚体补体受体)相互作用。目前，仍需要进一步的研究来阐明SLAMF7介导的肿瘤细胞吞噬作用的分子机制，以及鉴定结合SLAMF7以诱导吞噬作用的其它“吃我”（eat me）信号。

       Fc受体

       Fc受体属于细胞表面受体家族，与免疫球蛋白Fc域结合，可激活多种免疫细胞类型（包括巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、NK细胞和粒细胞）的下游信号通路。虽然传统上已知通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)发挥抗肿瘤作用，但免疫球蛋白G受体（FcγRs）也在通过吞噬作用介导的抗体依赖性细胞吞噬中发挥了主要作用。在人类FcγR家族，FcγRIIB是唯一的吞噬作用抑制性受体，而其它成员（FcγRI、FcγRIIA、FcγRC、FcγRIIIA、FcγRIIIB）均是吞噬作用激活受体。已有证据表明，利用治疗性抗体（如CD20抗体obinutuzumab[6]）靶向诸如FcγRs一样的吞噬作用激活受体是一种结合吞噬作用检查点阻断以促进肿瘤细胞吞噬清除的合理途径。

        三、桥接先天免疫力和适应性免疫力

        产生抗原特异性T细胞反应

尽管使用CD47抗体阻断吞噬作用检查点最初的抗肿瘤作用很大程度上归因于吞噬细胞对肿瘤细胞的直接清除，但越来越多的证据表明，适应性免疫系统，尤其是CD8+T细胞反应在CD47抗体发挥抗肿瘤作用中也起着至关重要的作用(图3)。举例来说，2015年，发表在Nature Medicine的一项研究[7]证实，CD47阻断触发了T细胞介导的免疫原性肿瘤破坏。2016年，发表在PNAS上的一项研究[8]证实, CD47阻断持久的抗肿瘤反应需要适应性免疫刺激：在同源B16F10黑色素瘤小鼠模型中，靶向CD47和小鼠黑色素瘤抗原酪氨酸酶相关蛋白1 (TRP-1)的抗体与PD-L1抗体协同，产生了持久的抗肿瘤响应，这是CD47抗体单药治疗或联合TRP-1抗体无法实现的。

图3 桥接先天和适应性抗肿瘤免疫力（图片来源：Nature Reviews Cancer ）

        cGAS-STING通路

       上述发表在Nature Medicine上的论文[7]还证实，CD47阻断的T细胞启动和抗肿瘤作用似乎依赖于抗原提呈细胞（如树突状细胞）中cGAS-STING信号的激活。具体来说，研究发现，在携带同源MC38肿瘤的野生型（不缺乏STING）小鼠中，使用CD47抗体治疗增加了I型干扰素的产生，并导致了抗肿瘤反应。然而，与来自野生型小鼠的树突状细胞相比，分离自缺乏STING的小鼠的树突状细胞在与肿瘤细胞一起培养并用CD47抗体治疗时，启动CD8+ T细胞的能力降低了。这些结果表明，至少在CD47阻断的情况下，宿主细胞中cGAS-STING通路的激活对干扰素的产生和抗肿瘤适应性免疫至关重要。

图4 吞噬作用与先天免疫感应通路激活（图片来源：Nature Reviews Cancer ）

       TLR通路

       先天免疫系统的细胞依赖于生殖细胞编码的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)和其它细胞表面受体快速检测微生物蛋白或肿瘤细胞上的膜分子。作为最具特征的模式识别受体(PRRs)，Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）能够检测释放到肿瘤微环境中的肿瘤相关损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)或吞噬体内癌细胞释放的肿瘤相关DAMPs，从而导致下游炎症通路激活（图4）。早在2008年发表的一篇综述[9]就已总结道，TLR激活对关键的免疫过程至关重要，这些免疫过程包括抗原的处理和交叉递呈、共刺激分子(包括CD80和CD86)的上调以及T细胞的招募和激活。尽管TLR激活在决定吞噬作用检查点阻断抗肿瘤反应中的作用还不清楚，但研究者们认为，对这些通路更深入的理解应该能够开发桥接先天抗肿瘤反应和适应性抗肿瘤反应的有效疗法，从而达到更强的抗癌作用。

       四、靶向吞噬作用检查点

       CD47-SIRPα轴是在癌症领域被研究的最透彻的吞噬作用检查点，靶向CD47-SIRPα轴的疗法现在在临床中被调查用于治疗多种人类癌症（表1）。研究证实，阻断CD47-SIRPα相互作用可导致针对癌细胞的吞噬作用，这种阻断可由多种方式实现，包括1）使用靶向CD47与SIRPα结合位点以阻断它们相互作用的CD47或SIRPα抗体[10,11,12]；2）使用由CD47或SIRPα胞外区域组成的重组蛋白（作用是与内源性蛋白形成竞争，影响CD47与SIRPα的正常结合）[13-15]；3）使用靶向调节CD47转录和/或转运通路的药物，以抑制CD47在癌细胞表面表达[16]。

表1 调查吞噬作用检查点阻断的临床试验

数据来源：Nature Reviews Cancer

       目前，吞噬作用检查点阻断，尤其是阻断CD47-SIRPα轴的疗法已被证明在血液学恶性肿瘤和实体恶性肿瘤中均是一种有前途的疗法，具有可接受的安全性和毒性特征。接下来，需要更大型的临床研究以及更长的随访时间来验证目前的发现。是否靶向其它吞噬作用检查点能够产生类似的治疗益处还有待观察。

       五、联合疗法

       将吞噬作用检查点阻断与调节吞噬作用或先天免疫细胞（如APC）功能的治疗方法（如抗体、细胞因子疗法、细胞毒性化疗或放疗）合理联合有望提高抗肿瘤反应（图5）。此外，将吞噬作用检查点阻断与调节适应性免疫系统的疗法（如T细胞免疫检查点抑制剂）相联合也正在被很多团队探索。

图5 吞噬作用检查点阻断联合疗法（图片来源：Nature Reviews Cancer ）

       治疗性抗体

       早在2010年发表在Cell上的一项研究[17]就已证实，在B细胞非霍奇金淋巴瘤临床前模型中，CD47抗体与CD20抗体rituximab联合可抑制肿瘤移植和生长，60%的小鼠实现了癌症消除，并获得了长期生存。之后有研究[192]证实，与rituximab或CD47抗体单独用药相比，一种共靶向CD47和CD20的双特异性抗体可改善对抗淋巴瘤细胞的抗肿瘤效应以及吞噬作用诱导。

       除了CD20抗体，临床前研究还显示，CD47抗体与治疗乳腺癌的HER2抗体[153]、治疗黑色素瘤的CD271抗体[18]、治疗小细胞肺癌的CD56抗体[19]以及治疗结肠癌的EGFR或EpCAM抗体[13]联合均增强了对吞噬作用的诱导，并改善了抗肿瘤作用。目前，一项多中心早期临床试验正在研究CD47抗体(Hu5F9-G4)与EGFR抗体cetuximab联合治疗局部进展期实体肿瘤的作用(表1)。

       细胞因子疗法

       目前积累的一些证据[14,20,21]表明，使用细胞因子、Toll样受体（TLR）激动剂、趋化因子或其它生长因子改变吞噬细胞表型的策略可能可与CD47阻断或其它吞噬作用检查点阻断相联合以诱导肿瘤细胞清除。

       化疗

       尽管化疗药物对体内的免疫细胞具有高度毒性，但这类疗法也能诱导肿瘤细胞中的DNA损伤，从而导致与“促吞噬作用信号calreticulin转移到细胞膜”有关的免疫原性细胞死亡（图5）。同样是上述2015年发表在Nature Medicine上的论文证实[7]，在CD47阻断前开始化疗提高了抗肿瘤效果，并保留了宿主对复发肿瘤的记忆反应。该研究表明，促吞噬作用信号calreticulin的诱导是化疗联合吞噬作用检查点阻断产生协同抗肿瘤作用的关键。不过，需要强调的是，化疗联合吞噬作用检查点阻断的治疗响应可能取决于多种因素，包括药物的类型、用药时间、剂量，被靶向的肿瘤类型，以及患者的免疫状态。因此，更深入地了解控制细胞毒性药物和吞噬作用检查点阻断剂之间潜在协同作用的机制将为开发有效的癌症治疗联合方案提供关键的见解。

       放疗

       CD47阻断联合放疗也被研究以增强抗肿瘤效果。不仅有研究表明，CD47阻断具有放射保护作用，还有证据显示，放射线诱导的炎症反应可能会使肿瘤对吞噬作用检查点阻断更加敏感，因此有理由进一步研究这种联合治疗方案。

       适应性检查点阻断

       目前，已有一些研究证实，将吞噬作用检查点阻断与适应性检查点阻断（如大家所熟知的PD-1/PD-L1抗体）相联合可增强抗癌作用。举例来说，前文提到的2016年发表在PNAS上的一篇论文[8]证实，CD47抗体可与PD-L1抗体协同，以改善对B16F10黑色素瘤的治疗效果；2018年，发表在Cell Reports上的一篇论文[22]证实，与PD-L1 或SIRPα阻断单药治疗相比，靶向PD-L1和SIRPα的双特异性融合抗体（bispecific fusion antibody）增强了抗肿瘤反应。

       六、总结

       目前来说，不管是单药治疗，还是与其它药物联合，评估吞噬作用检查点阻断作为一种癌症免疫疗法的早期临床试验均报道了令人兴奋的结果（表1），比如，2018年发表在NEJM[23]上的一项Ib期试验结果显示，CD47抗体Hu5F9-G4联合CD20抗体rituximab治疗难治或复发性非霍奇金淋巴瘤患者获得了50%的客观缓解率，完全缓解率为36%，且这一联合治疗的耐受性良好。此外，今年4月，利用可溶性SIRPα Fc融合蛋白TTI-621阻断CD47-SIRPα轴的疗法也在Sézary综合征（皮肤T细胞淋巴瘤的一种白血病变体）患者中显示了有前途的早期临床结果。尽管相关试验仅纳入了非常有限的5例患者，但其结果为CD47-SIRPα阻断治疗高度侵略性的T细胞恶性肿瘤提供了积极的支持[24]。这些不断积累的数据表明，靶向吞噬作用检查点为开发新型癌症免疫疗法提供了新的途径，有望带来癌症治疗领域的新突破。

       小结

      系列：深度综述——癌症免疫疗法新靶点“吞噬作用检查点”

      杂志：Nature Reviews Cancer

      亮点：来自美国希望之城综合癌症中心等机构的6位科学家在一篇最新综述中详细介绍了过去20年在识别吞噬作用检查点（以CD47-SIRPα轴为主）方面取得的进展，以及支持在癌症治疗中使用吞噬作用检查点阻断的临床前和早期临床证据。同时，文章讨论了阻断吞噬作用检查点后调控先天和适应性抗肿瘤免疫反应的机制，并强调如何桥接免疫系统的这两个分支来是产生最佳抗肿瘤免疫力的关键。

相关论文：

[1] Mingye Feng et al. Phagocytosis checkpoints as new targets for cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer (2019) .

[2] Seiffert, M. et al. Human signal-regulatory protein is expressed on normal, but not on subsets of leukemic myeloid cellsand mediates cellular adhesion involving its counterreceptor CD47. Blood (1999).

[3] Gordon, S. R. et al. PD-1 expression by tumour-associated macrophages inhibits phagocytosis and tumour immunity. Nature(2017).

[4] Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nat. Rev. Cancer (2004).

[5] Barkal, A. A. et al. Engagement of MHC class I by the inhibitory receptor LILRB1 suppresses macrophages and is a target of cancer immunotherapy. Nat. Immunol. (2018).

[6] Golay, J. et al. Glycoengineered CD20 antibody obinutuzumab activates neutrophils and mediates phagocytosis through CD16B more efficiently than rituximab. Blood (2013).

[7] Liu, X. et al. CD47 blockade triggers T cell-mediated destruction of immunogenic tumors. Nat. Med. (2015).

[8] Sockolosky, J. T. et al. Durable antitumor responses to CD47 blockade require adaptive immune stimulation. Proc. Natl Acad. Sci. (2016).

[9] Rakoff-Nahoum, S. & Medzhitov, R.Toll-like receptors and cancer. Nat. Rev. Cancer (2009).

[10] Majeti, R. et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell (2009).

[11] Willingham, S. B. et al. The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPα) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proc. Natl Acad. Sci. (2012).

[12] Liu, J. et al. Pre-clinical development of a humanized anti-CD47 antibody with anti-cancer therapeutic potential. PLOS ONE (2015).

[13] Weiskopf, K. et al. Engineered SIRPα variants as immunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies. Science(2013).

[14] Lin, G. H. Y. et al. TTI-621 (SIRPαFc), a CD47-blocking cancer immunotherapeutic, triggers phagocytosis of lymphoma cells by multiple polarized macrophage subsets. PLOS ONE (2017).

[15] Petrova, P. S. et al. TTI-621 (SIRPαFc): a CD47-blocking innate immune checkpoint inhibitor with broad antitumor activity and minimal erythrocyte binding. Clin. Cancer Res. (2017).

[16] Betancur, P. A. et al. A CD47-associated super-enhancer links pro-inflammatory signalling to CD47 upregulation in breast cancer. Nat. Commun. (2017).

[17] Chao, M. P. et al. Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma. Cell (2010).

[18] Ngo, M. et al. Antibody therapy targetingCD47 and CD271 effectively suppresses melanoma metastasis in patient-derived xenografts. Cell Rep. (2016).

[19] Weiskopf, K. et al. CD47-blocking immunotherapies stimulate macrophage-mediated destruction of small-cell lung cancer. J. Clin. Invest. (2016).

[20] Zhang, M. et al. Anti-CD47 treatment stimulates phagocytosis of glioblastoma by M1 and M2 polarized macrophages andpromotes M1 polarized macrophages in vivo. PLOS ONE (2016).

[21] Bian, Z. et al. CD47–SIRPα interaction and IL-10 constrain inflammation-induced macrophage phagocytosis of healthy self-cells. Proc. Natl Acad. Sci. (2016).

[22] Liu, X. et al. Dual targeting of innateand adaptive checkpoints on tumor cells limits immune evasion. Cell Rep. (2018).

[23] Advani, R. et al. CD47 blockade by Hu5F9-G4 and rituximab in non-Hodgkin’s lymphoma. N. Engl. J. Med. (2018).

[24] Johnson, L. D. S. et al. Targeting CD47 in Sezary syndrome with SIRPαFc. Blood Adv. (2019).