解码基因编辑

　　在把CRISPR-Cas9送到细胞中时，需要借助载体的帮助。其中病毒载体是目前最流行的递送方式，但其成本高、存在脱靶效应，还会对人体产生致癌风险。而这次浙江大学研究团队的最新成果，为非病毒载体在基因编辑中的运用打开了另一扇窗。

　　精确定位并切断DNA上的基因位点，关闭某个基因或引入新的基因片段，让失去希望的病人重获治愈的可能……CRISPR基因编辑技术，自问世以来就被誉为“上帝的手术刀”。

　　但是，这个神奇的“手术刀”居然也有失手的时候，其脱靶效应一直是阻碍其应用的关键障碍之一。

　　近日，由来自南京大学、厦门大学和南京工业大学的科研人员，开发出一种“基因剪刀”工具的新型载体，可实现基因编辑可控，在癌症等重大疾病治疗方面具有广阔的应用前景。目前，该成果已在新一期美国《科学进展》杂志上发表。

　　   来自病毒载体的担忧

　　转基因大豆油、抗虫棉花、甚至是免疫艾滋病的基因编辑婴儿……虽然争论不休，但在短短数十年时间里，基因编辑技术作为一个新时代的产物，还是迅速地跟多数普通人建立起联系。但是，说到其中运用的工具和原理，很多人就不太熟悉了。

　　自上世纪60年代揭示遗传密码的秘密之后，人类对基因的改造尝试就从未停止过。用更形象的说法，基因编辑可以理解为，利用“基因剪刀”将DNA链条断开，对目标DNA片段进行改造的过程，无论是增添还是敲除基因，本质上都是从分子水平改变生物的性状。

　　目前，科学家们最普遍使用的“基因剪刀”是一种名为CRISPR-Cas9的外源DNA，它的诞生离不开细菌。病毒为了自身繁衍利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌在与病毒抗争的过程中，在体内进化出CRISPR系统，能够不露声色地将病毒基因从自己的染色体上切除。科学家们正是利用了这一特性，开发出了这款尖端的“基因剪刀”。

　　如何把CRISPR-Cas9送到细胞中去？这就需要借助到载体的帮助。

　　根据基因载体来源，我们可以把基因载体分成5大类，分别是质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、非病毒载体和微环DNA。其中病毒载体是目前最流行的递送方式，截至2018年6月，临床试验中超过70%的基因药物载体为病毒。将复合物连接到病毒后，病毒侵入靶细胞的细胞核，CRISPR-Cas9这把“基因剪刀”才能发挥出真正的功能。

　　逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV），这三大类病毒，已经在提供遗传物质的治疗方面进行了广泛的应用。然而，构建病毒载体是一个艰苦而且高成本的过程，并且运用这些病毒载体递送并不能做到万无一失。“CRISPR-Cas9的优势很明显，劣势也明显。它存在脱靶效应，也可能会切断目标之外的其他区域，对正常的区域进行切除时，就会产生很大的损伤。”南京大学现代工程与应用科学学院教授宋玉君说。

　　研究表明，病毒类载体在CRISPR-Cas9系统中存在着固有缺点，包括致癌风险，插入大小限制以及会在人体内产生免疫反应。例如，逆转录病毒可能造成插入性突变，导致癌症发生，向静脉高剂量注射AAV用于基因治疗也会产生严重毒性。

　　  更安全的基因编辑载体来了

　　病毒作为运输载体用于基因工程的安全性还不能完全掌控，因此科学家们提出了几种替代的非病毒递送材料，包括金纳米颗粒、黑磷、金属有机骨架、氧化石墨烯和各种纳米材料。

　　相比病毒，这些材料在安全性上有了很大的提升。但是，基因编辑的时间和基因编辑的

　　过程，仍然无法为科学家所控制。

　　发表在《科学进展》杂志上的最新科研成果中，来自南京大学、厦门大学和南京工业大学的科研人员开发出一种“基因剪刀”工具的新型非病毒载体，可以通过近红外光控制“修剪”基因的方式，实现体内时间和空间上的基因编辑可控，在癌症等重大疾病治疗方面具有广阔的应用前景。

　　针对CRISPR-Cas9的脱靶效应，研发团队经过长达一年半的试验，研发出一种名叫“上转换纳米粒子”的非病毒载体，这种纳米粒子可以被细胞大量内吞，通过一种光敏化合物将CRISPR-Cas9锁定在上转换纳米粒子上。

　　宋玉君表示：“红外光具有强大的组织穿透性，这为在人体深层组织中安全、精准地应用基因编辑技术提供了可能。”

　　实验的触发装置就在于两种光——近红外光和紫外光。近红外光和紫外光具有特殊的性质，前者可以穿透人体组织到达目标位置，后者则可以实现切断光敏分子。暴露在近红外光下，这些纳米粒子吸收低能近红外辐射并将其转化为可见的紫外光，能够自动打开纳米粒子和Cas9蛋白之间的“锁”，使Cas9蛋白进入细胞核，从而实现对靶点基因精准敲除，诱发肿瘤细胞凋亡。

　　该团队从基因、蛋白及细胞等多个角度对该体系的有效性进行了验证，在对荷瘤小鼠进行治疗的过程中团队发现，只有近红外光照射实验组的肿瘤得到了有效抑制，且从20天后取下的肿瘤大小来看，实验组肿瘤远远小于对照组。

　　该技术为非病毒载体在基因工程上的运用打开了另一扇门。一旦未来这项技术能够实现临床，肿瘤尤其是实体瘤就能实现无创治疗，帕金森症、糖尿病等患者也能从这项技术中受益。

　　   非病毒载体未来无可限量

　　病毒载体虽然在临床中广泛使用，但其安全不确定性、高昂的制备及运输费用制约着其在基因工程中的推广前进。因此，非病毒载体越来越引起研究者的注意。

　　“目前，各种纳米材料的非病毒载体都有科研人员在做，比如可降解的生物高分子材料，它的前景是非常大的。”宋玉君告诉记者。

　　关于非病毒载体的研究有两个方向，一个是有机材料基因递送体系，另一个是无极材料基因递送体系。在有机材料研究领域中，脂质体、聚乙烯亚胺及其衍生物、阳离子多肽、树形分子及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、聚氨基酯、环糊精及其衍生物为科学家研究的主要方向。

　　各类脂质体设计的非病毒脂质纳米粒子易于制备，免疫反应不剧烈，而且有更大的有效荷载，因此已经在临床中被广泛运用，如疫苗和基因药物递送、癌症治疗、肿瘤影像学等都会使用这种递质。以聚乙烯亚胺及其衍生物为载体的递送系统也已经运用在多重疾病的临床试验中，包括卵巢癌、胰腺癌、原发性腹膜恶性肿瘤、多发性骨髓瘤等。而其他的递质材料的研究基本没有进入临床阶段。

　　相比于有机材料，无机材料则更容易人为控制，它的尺寸可调，表面也容易修饰。金纳米粒、碳纳米管、石墨烯、上转换纳米粒等材料均有广泛研究，主流的递送方式包括将负电基因与正电无机纳米粒形成复合物、将基因以响应性共价键形式连接在纳米粒上或者在无机纳米粒表面修饰两亲性高分子，负电荷基因通过静电作用吸附在高分子层中。宋玉君所在团队研发的光操纵基因编辑新技术还是第一次。

　　目前，无机递送材料的研究还停留在实验室阶段，临床阶段的试验尚未批准，关于它对机体的影响还没有确切的定论。

　　“无机纳米粒子含有人体非必须的元素，因此可能会产生一些副作用。我们在实验时，对小鼠层面观察时间比较短，少至几周多则几个月，在细胞层面和动物层面还没有发现大的影响。如果能够找到合适、安全、具有相同功能的无机材料，它的前景将会无可限量。”宋玉君对非病毒载体的未来充满信心。