免疫系统在肿瘤监测和清除的进程中起着非常重要的作用，肿瘤细胞在多种机制的帮助下做出免疫逃逸被认为是癌症进展的标志之一。作为免疫疗法的重要代表，免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitor，ICI）对一些转移性癌症患者非常有益，但通常需要预测性生物标志物来诊断患者。自肿瘤突变负荷（TMB）与免疫治疗获益之间的密切关系被揭示以来，围绕TMB的研究也越来越丰富。去年10月，美国NCCN（综合癌症网络）将TMB正式列入非小细胞肺癌（NSCLC）指南，最近一期的Nature Genetics杂志发表了一篇关于TMB的研究文章，为TMB作为免疫疗法标志物落下了“实锤”。

肿瘤微环境中的免疫应答过程（图片源自参考文章3）

　　以TMB作为标志物临床早已有应用，在CTLA-4抑制剂治疗黑色素瘤，PD-1/PD-L1抑制剂治疗黑色素瘤、膀胱癌和NSCLC中均有观察到高突变负荷TMB和临床效益之间的关联性。但既往研究ICI治疗后TMB与生存率关系的临床样本量较小，目前对TMB是否具有各种癌症临床获益的预测性尚无十足把握，也不清楚这种获益一旦超出临床特定试验人群后是否还有效。为了获得更广泛地数据，这项最新研究共囊括1662名接受ICI治疗晚期癌症和5371名未接受ICI治疗患者的临床和基因组数据，并对这些患者的肿瘤采用了新一代靶向测序技术MSK-IMPACT。结果发现在所有患者中，高TMB（不同肿瘤组织均值约20%）与较好的总生存期（OS）呈正相关，证明在大多数癌症中，TMB升高与生存率提高之间存在相关性。

不同癌症TMB的阈值与死亡危害比之间的关系（图片源自参考文章2）

　　此外，该研究还对每个癌症类型进行了区别性分析，将每个组织学中突变负荷最高的前20%作为该癌症类型的TMB高组。这样操作的原因是TMB在不同组织学中分布不同，每种癌症类型TMB前20%的阈值存在显著差异，也就是说不可能有一个通用的阈值定义“何谓高TMB”，来预测ICI在所有癌症类型中的临床效益。这种不同肿瘤组织学的TMB差异以及对ICI应答阈值的差异很可能是由于肿瘤微环境造成的，包括单克隆免疫渗透、免疫细胞排斥、人类白细胞抗原基因型变化和检查点分子的表达水平等因素。

TMB程度在不同癌症类型中的分布情况（图片源自参考文章2）

　　这种分层研究更有利于观察不同癌症类型的OS与TMB的关联，虽然可能由于样本量的原因，对个别癌症（如胶质瘤）的影响没有达到统计学意义，但几乎所有类型的癌症都观察到了高TMB与整体生存率较高的大趋势，这些都说明TMB与ICI术后生存率提高之间的关系可能存在于大多数癌症类型中。TMB在许多癌症组织学上作为一个连续变量，在较长的OS中都能观察到类似的标志物关联性趋势。与OS的改善一致，在如NSCLC、黑色素瘤、食管胃癌、头颈癌和肾细胞癌等类型中，TMB与ICI的客观缓解率（ORR）或PFS之间也存在类似的相关性。

TMB程度与总生存期之间的关联性（图片源自参考文章2）

　　研究人员还对5371名转移性癌症并且没有接受过ICI治疗的患者肿瘤做了MSK-IMPACT测序，在这些患者中，TMB的升高与OS的提高没有关联性。这就排除了这种TMB与患者生存率的正关联仅仅是由预后患者间的TMB差异导致的，而与ICI治疗无关这样一种可能。
　　这项研究成果解决了肿瘤免疫学中几个重要的基本问题：一是验证了突变负荷可以用来预测接受抗CTLA-4或抗PD-1治疗患者的生存率。二是这项研究采用了迄今为止使用ICI治疗的最大规模患者基因组数据，可以对TMB的临床疗效影响进行量化分析，证明较高TMB与较高OS之间的持续相关性。最后，研究发现对“高”TMB的定义要因癌症不同类型而异，很难用一个通用阈值来预测所有癌症患者从ICI获益的可能。总之，这一发现再次强调了TMB作为预测性生物标志物的可靠性，具有重要的临床价值。

TMB作为标志物对ICI治疗NSCLC的临床获益预测（图片源自参考文章2）

　　鉴于免疫治疗的潜在毒性和对ICI的高度可变反应，以及这类疗法的巨大经济成本，迫切需要能够用来预测指导ICI用药的阳性或阴性预测生物标志物。阳性预测可以正确判断哪些患者能够产生治疗响应；而阴性预测用来确定哪些患者从当前疗法中无法获益。利用生物标志物可以对患者进行单药或联合用药的分组，或是决定将免疫疗法用于不同患者群的一线和挽救治疗，或是采用替代疗法以避免不必要的毒性。除TMB外，目前已验证具有免疫疗法生物标志物作用的有PD-L1表达、淋巴细胞浸润水平、T细胞受体克隆性、外周血标志物、免疫相关基因表达以及多路复用免疫组化等，下面简要介绍一下。
　　1、PD-L1表达
　　在Nivolumab用于黑素瘤、NSCLC、肾细胞癌、前列腺癌和结直肠癌的I期临床研究中发现，通过检测肿瘤细胞的PD-L1表达可以作为抗PD-1、PD-L1治疗的生物标志物。将5%设定为肿瘤细胞PD-L1阳性阈值，在25例PD-L1阳性患者中有9例（36%）对Nivolumab出现ORR，阴性患者中没有表现出ORR，在晚期黑色素瘤和NSCLC患者中阳性组比阴性组的PFS和OS也都有显著提高，FDA已批准将PD-L1伴随诊断用于晚期NSCLC和膀胱癌的治疗。但是受PD-L1表达多机制调控和肿瘤微环境影响，PD-L1的表达具有取样时间差异、患者个体差异、甚至瘤内异质性，其阴性预测作用要低很多。
　　尽管存在这些局限性，PD-L1表达在免疫疗法确定受益患者群仍发挥着重要作用，特别是在相关临床试验中，确保PD-L1阳性肿瘤患者在比较群组中的平均分布是非常必要的，可以避免由生物学差异而引入的实验偏差。
　　2、淋巴细胞浸润水平
　　许多癌症的回顾性研究都发现，淋巴细胞的浸润程度与患者生存率有关联，在实体肿瘤聚集处，如结直肠癌和黑色素瘤中发现异位淋巴结状结构能够更好地预测患者生存。例如，与CD8+肿瘤浸润淋巴细胞程度较低的放化疗III期NSCLC患者相比，肿瘤浸润程度高的患者群PFS和OS都更长。这种淋巴细胞浸润程度的背后机理被认为是能够激起自身免疫应答或T细胞炎症肿瘤表型，通过免疫机制改善疾病控制，因此可以作为预后生物标志物。
　　3、T细胞受体克隆
　　研究发现肿瘤淋巴细胞浸润的T细胞受体靶向肿瘤特异性免疫反应，与Pembrolizumab的临床应答相关，结果表明基线T细胞受体克隆性与肿瘤浸润淋巴细胞密度的相关性不高。当浸润淋巴细胞限制了T细胞受体对肿瘤抗原的特异性克隆，即便是肿瘤浸润淋巴细胞密度较低的患者，仍然可以在抗PD-1治疗中获益。当然这种假设尚需要从大量临床试验中得到进一步验证，并且可能还需要确认可识别的肿瘤抗原，然后才能将该方法应用于生物标志物。
　　4、外周血标志物
　　外周血标志物的优势在于非侵入性的样品采集方式，虽然这类标志物与临床疗效的一些关联性已有研究，但是尚未有这类标志物真正“落地”具备疗法预测性。以Ipilimumab为例，相关临床研究发现以下指标与患者PFS有关，包括低绝对中性粒细胞计数(< 7500个细胞/μL)，中性粒细胞淋巴细胞比例低(< 3)，绝对的单核细胞计数低(< 650细胞/μL)，低频髓样抑制细胞(< 5·1%)、高频FoxP3+调节性T细胞(≥1·5%)，高频率的淋巴细胞(≥10·5%)，以及高嗜酸性粒细胞计数(≥50个细胞/μL)，在抗PD-1治疗研究中也发现了一些类似的结果。此外，外周T细胞数量，尤其是T细胞受体基因序列或对新抗原的反应性评估也可以作为一种预测生物标志物发挥潜在作用。
　　5、免疫相关基因表达
　　通过基因表达对肿瘤微环境中活跃的先天或适应性免疫反应进行更广泛的评估，可以有效地预测ICI疗法的临床效益。对晚期黑色素瘤患者使用Ipilimumab的II期临床回顾性分析证明，基因表达谱图确实是一种有用的预测生物标志物。研究人员提取了50份治疗前肿瘤活检标本的总RNA进行分析，将患者分为有临床应答和无应答两组，对两组之间存在显著差异的基因进行通路分析后发现关联炎症反应。22个与免疫相关的基因表达至少增加了2·5倍，包括细胞毒性T细胞（如CD8A、颗粒酶B、穿孔蛋白I）、Th1细胞因子或趋化因子、MHCII类和其他免疫相关基因(如NKG7、IDO1)的标志物，均与OS延长相关。
　　6、多路复用免疫组化
　　通过多重免疫组化技术直接评价肿瘤和免疫细胞表型及其空间关系，提供了肿瘤微环境免疫状态的信息，这些信息可以作为基因表达谱的补充。包括用单个初级抗体对肿瘤切片进行连续染色，以获得感兴趣的蛋白质，并用显色或免疫荧光法进行检测，这种多光谱方法在临床应用中具有很大的潜力。通过建立多光谱免疫组化平台，分析黑色素瘤载片上的CD3、CD8、FoxP3、CD163和PD-L1，预测哪些患者能够成功生成肿瘤浸润淋巴细胞，选择合适的细胞疗法。仅CD8+ T细胞的存在不足以预测肿瘤浸润淋巴细胞的成功生长，但是CD8+ T细胞与CD3+FoxP3+调节性T细胞比值与肿瘤浸润淋巴细胞的成功生长密切相关。PD-L1+的加入使阴性预测值提高了100%，这种方法也可以应用于其他免疫疗法。
　　7、标志物合用策略
　　将两种或两种以上标志物策略联合使用来捕捉肿瘤微环境免疫状态，可以对ICI治疗更有效。以PD-L1表达和淋巴细胞浸润为例，两者可能在肿瘤细胞呈现相反的情况，PD-L1表达较高时肿瘤浸润淋巴细胞计数较低，反之亦然，在这种情况下，抗PD-1或抗PD-L1单一治疗的临床响应可能较低，而仅以PD-L1表达或肿瘤浸润淋巴细胞密度作为生物标志物，会产生错误的预测。同样，并非所有高突变或新抗原负荷肿瘤都表现出“先天”的免疫性，这被认为是免疫治疗方法的先决条件之一。肿瘤微环境中还存在多种并发免疫抑制机制，包括CTLA-4、PD-L2、LAG3、IDO1和IL-10，随着新的联合治疗策略的出现，这些都可能成为重要的识别靶点。

　　参考文章：
　　[1]BMS Withdraws Application for Nivolumab/Ipilimumab in TMB-High NSCLC.
　　[2]Tumor mutational load predicts survival after immunotherapy across multiple cancer types.
　　[3]Predictive biomarkers for checkpoint inhibitorbased immunotherapy.
　　[4]Approaches to treat immune hot, altered and cold trumors with combination immunotherapies.